專利名稱：一種y染色體str基因座熒光檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因座熒光標記復(fù)合擴增檢驗系統(tǒng)，具體涉及ー種Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(STR)是目前普遍應(yīng)用的遺傳標記，是2-6個bp長的串聯(lián)重復(fù)序列，其長度在幾十到幾百bp之間。這種串聯(lián)重復(fù)形成的DNA序列可以產(chǎn)生數(shù)以億計的基因型組合，而每ー種組合在群體中出現(xiàn)的頻率都非常低，也就是說，STR基因座具有極高的個體鑒定能力，所以常作為遺傳標記而被用于DNA分析技術(shù)中法醫(yī)個體識別、親緣關(guān)系鑒定，同時也是DNA數(shù)據(jù)庫建立的主流技術(shù)。90年代初STR基因座多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)，特別是STR基因座具有片段小容易擴增，適宜于檢驗微量和降解檢材，而且各基因座的擴增條件相似而能夠復(fù)合擴増，因而具有靈敏、準確、快速、信息量大等優(yōu)點。尤其是在建立DNA數(shù)據(jù)庫 方面，STR復(fù)合擴增技術(shù)具有極大的優(yōu)越性。Y染色體是性染色體的ー種，屬于近端著絲粒染色體。根據(jù)遺傳方式不同可以將其分為兩個區(qū)，即位于Y染色體兩端的擬常染區(qū)(pseudoautosomal region, PAR)和Y特異區(qū)。減數(shù)分裂吋，擬常染區(qū)要與X染色體進行交換重組，而Y特異區(qū)則不發(fā)生交換，由父親獨立向下遺傳給兒子，并且存有父系祖先的突變記錄，是形成Y特異區(qū)多態(tài)性的基礎(chǔ)。Y染色體突變率不超過常染色體，Y染色體的遺傳標記位于非重組區(qū)，也就是說整個非重組區(qū)相當于ー個遺傳標記，因此Y染色體遺傳標記的個人識別能力和親權(quán)鑒定能力不能像常染色體那樣使用相乘原則，個人識別和親權(quán)鑒定的評估十分有限。但是在國際慣例里面必須有三個以上基因座不同才能否認有血緣關(guān)系。為了達到足夠的排除概率，法醫(yī)DNA分析必須盡可能增加更多的Y染色體遺傳標記。在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域，DNA分析主要依賴商業(yè)化的試劑盒進行。其中Applied Biosystems公司在2004年秋發(fā)布的包含17個Y-STR基因座的Yfiler 試劑盒，包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389 I、DYS389 II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y GATA H4、DYS448，是目前可復(fù)合擴增Y-STR最多的商品化試劑盒和無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有線公司在2011年研發(fā)的Y18試劑盒在Yfiler 的基礎(chǔ)上增加了 DYS447。這些現(xiàn)有試劑盒主要是按照歐洲人群(主要為白人群體)統(tǒng)計選擇的基因座位點，其中不少基因座的多態(tài)性在中國人群中比較低，如DYS391在中國人群中多態(tài)性小于O. 4，因而造成了個體識別能力低，在法醫(yī)鑒定的實際應(yīng)用中會遇到瓶頸，比如嫌疑人與不同幾個家系的成員分型匹配，造成無法排查的情況，浪費了大量的人力物力。且由于Y染色體容易存在缺失的情況，造成基因座的丟失本應(yīng)是同一個家系的無法認定，誤導了偵破方向。因此，開發(fā)ー種基因座多態(tài)性高和能同時檢測更多基因座的試劑盒，成為親子鑒定、法醫(yī)檢測家系排查等迫切需要。且這個試劑盒與現(xiàn)有Y染色體STR的檢測試劑盒，比如ABI的Yfiler試劑盒聯(lián)用進行Y染色體STR基因座的檢測，能夠明顯地提高Y染色體DNA檢驗系統(tǒng)的累計個體識別能力和累積非父排除率，更加符合DNA檢驗的技術(shù)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒。本發(fā)明的另ー目的是提供上述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
根據(jù)過去十幾年針對中國人群Y染色體的研究，篩選 出針對中國男性GD (genediversity)數(shù)值高的Y染色體STR基因座，分別設(shè)計了其相對應(yīng)的擴增引物，可同時分析人Y染色體DNA 24個基因座多態(tài)性。所述24個基因座見下表I :
表I
權(quán)利要求
1.一種Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于包含以下24個基因座的擴增引物核苷酸序列DYS531 :SEQ ID NO: I 2 ;DYS630 :SEQ ID NO: 3 4 ;DYS622 :SEQ IDNO:5^6 ；DYS552 SEQ ID NO:7 8 ;DYS510:SEQ ID NO:9 10 ;DYS449:SEQ ID NO:ll 12;DYS459a 和 DYS459b :SEQ ID NO: 13 14 ;DYS446 :SEQ ID NO: 15 16 ;DYS443 :SEQ IDNO: 17^18 ；DYS635 SEQ ID NO: 19 20 ;DYS587 :SEQ ID NO:21 22 ;DYS527a 和 DYS527b SEQ ID NO:23^24 ；DYS460 SEQ ID NO: 25 26 ;Y - GATA-A10 :SEQ ID NO: 27 28 ;DYS520 :SEQ ID NO:29^30 ；DYS557 SEQ ID NO:31 32 ;DYS522 :SEQ ID NO:33 34 ;DYS481 :SEQ IDNO: 35 36 ；DYS570 SEQ ID NO: 37 38 ;DYS385a 和 DYS385b SEQ ID NO: 39 40 ；DYS444 SEQID N0:41 42。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于24個基因座的擴增引物濃度分別如下DYS531 和 DYS552 :0. 20 u M ；DYS630 :0. 25 u M ；DYS622 :0. 40 u M ;DYS510、DYS443和 DYS635 0. 80 u M ；DYS449 :0. 35 u M ；DYS459a 和 DYS459b :0. 55 u M ；DYS446 :0. 70 u M ；DYS587 1. 50uM ;DYS527a、DYS527b 和 DYS520 1. 35 u M ；DYS460 :0. 55 u M ； Y-GATA-A10 I.60 u M ；DYS557 1. 55 u M ；DYS522 1. 20 u M ；DYS481 1. 85 u M ;DYS570、DYS385a 和DYS385b 2. OOuM ；DYS444 :3. 00 u M ； 所述弓I物濃度均為上、下游弓I物的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于每個基因座對應(yīng)的引物中至少有一條序列的5’端進行熒光染料標記，熒光染料標記物為6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于24個基因座的擴增引物核苷酸序列分為4組，分別進行5’端熒光染料標記 第一組DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510 和 DYS449，熒光染料標記物為 6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一種； 第二組DYS459a、DYS459b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a 和 DYS527b，熒光染料標記物為6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一組未使用的任意一種； 第三組DYS460、Y - GATA-AlO、DYS520、DYS557 和 DYS522，熒光染料標記物為 6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一組和第二組均未使用的任意一種； 第四組DYS481、DYS570、DYS385a、DYS385b 和 DYS444，熒光染料標記物為 6_FAM、HEX、TAMRA或ROX中前三組均未使用的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)設(shè)有內(nèi)標，內(nèi)標用SIZ作為橙色熒光標記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)還包括反應(yīng)混合液和熱啟動Taq酶，所述反應(yīng)混合液組成為MgCl2 7. 5mM, Tris-HCl 125mM,KCl 125mM, dNTPs 7. 5mM, BSA 2g/L。
7.權(quán)利要求r6任一所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟為 將試劑盒內(nèi)試劑與樣品DNA裝入PCR擴增管，置于熱循環(huán)儀上，進行PCR擴增，擴增程序為95°C變性 llmin ;94°C lmin、62°C Imin 和 72°C Imin 共 10 個循環(huán)；90°C lmin、59°CImin和72°C Imin共20個循環(huán)；60°C延伸60min ;4°C保溫得到擴增產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進行熒光檢測，再用片段分析軟件GeneMapper分析遺傳分析儀檢測收集的數(shù)據(jù)。
8.權(quán)利要求f 6任一所述Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒在法醫(yī)個體識別、親權(quán)鑒定、人口遷移進化研究、人口歷史和家系變化研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Y染色體STR基因座熒光檢測試劑盒及其應(yīng)用，屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒包含人Y染色體上24個基因座(DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570和DYS444)相對應(yīng)的擴增引物。該檢測試劑盒能夠提高針對中國男性的累計個體識別力和累積非父排出率，提高個體鑒別力，對于法醫(yī)個體識別、親權(quán)鑒定、人口遷移進化研究、人口歷史和家系變化研究等多個領(lǐng)域都有實踐意義。
文檔編號G01N21/64GK102676676SQ20121014963
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者劉宏, 劉超, 徐曲毅, 曹淵, 李越, 葛斌文, 鄭衛(wèi)國, 陳林麗 申請人:廣州市刑事科學技術(shù)研究所, 無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司