專利名稱：一種微藻蛋白組的分析方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物燃料領域，涉及ー種微藻蛋白組的分析方法。
背景技術：
隨著人類社會的不斷發(fā)展，對能源的需求與日俱增，在化石燃料資源日益枯竭的情況下，可持續(xù)能源的開發(fā)顯得尤為重要。生物能源領域是一個新興的能源研究領域，包括生物こ醇和生物柴油等。其中，生物こ醇的應用存在技術兼容性差等問題，使得生物柴油具有了更大的優(yōu)勢。目前生物柴油的生產(chǎn)，主要是通過產(chǎn)油植物，包括各種豆類等，然而植物的生長、生存環(huán)境的限制，使得產(chǎn)油過程受季節(jié)、環(huán)境影響嚴重?，F(xiàn)在，通過微藻生產(chǎn)柴油，已經(jīng)成為ー種熱門的生產(chǎn)途徑。由于微藻生長迅速，可在海水及污水等惡劣環(huán)境中生長，不占用耕地，產(chǎn)油效率高，其研究具有重要的意義。藻產(chǎn)油尚在起步階段，在其發(fā)展成為可以適應大規(guī)模エ業(yè)生產(chǎn)之前還有許多技術知識需要積累，而微藻培養(yǎng)過程中相關的蛋白質(zhì)研 究就是其中一個關鍵方向，目前微藻相關的蛋白組學研究方法幾乎是空白。因此，對微藻油脂積累過程中的蛋白組監(jiān)控的方法的開發(fā)就顯得尤為重要了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種微藻蛋白組的分析方法。本發(fā)明的技術方案概述如下一種微藻蛋白組的分析方法，包括如下步驟(I)微藻細胞收集取出已培養(yǎng)好的微藻藻液樣品，在3000-5000^111,4^條件下離心3_4min,收集下層的細胞，用水清洗細胞后，在3000-5000rpm，4°C條件下離心3-4min，收集下層的細胞在_80°C下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞；(2)提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì)①從凍干細胞中取4份，每份50_100mg，分別置于離心管中，每管加入O. 5_lmL細胞裂解液，混勻，以每超聲8-10s，間歇5-6s的方法冰上間歇超聲破碎共40-60s ;加入5-15 μ L的質(zhì)量比為2-4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10_30min ；加入5-15yL80-120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置l_3h ;12000-15000rpm離心25-40min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細胞裂解液為8M尿素，質(zhì)量濃度為4%的3_[(3 —膽酰胺丙基)一二こ胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量為水；②測定蛋白濃度采用Bradford試劑盒，將標準牛血清蛋白溶液由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，配制成系列溶液，測定系列溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；按相同方法測定步驟①獲得的4份蛋白溶液蛋白的濃度；③沉淀蛋白分別取4份步驟②獲得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50_150yg蛋白，每份加入蛋白溶液體積4-6倍的-20°C —40 °C的丙酮，沉淀12-20h ;離心，棄上清，沉淀用-20°C —40°C的體積濃度為70%-85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；_80°C貯存；④蛋白還原以及酶解
向步驟③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10-40 μ L 40_60mM的三こ基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；加入l-4yL三(2-羧こ基)膦，在50-60°C反應lh，對各個蛋白進行還原化處理；然后加入1-2 μ L甲基硫代磺酸甲酷，室溫反應10-15min，終止還原反應；加濃度為O. 2-0. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液20-30 μ L，37°C反應12-18小時，進行蛋白酶解；⑤肽標記在每個蛋白酶解液中分別加入一管用60-80 μ Lこ醇溶解的iTRAQ標記試劑，室溫反應Ih ；⑥溶液混合將步驟⑤獲得的4份溶液混合成混合液，于_40°C保存； (3)差異表達蛋白鑒定將步驟(2)⑥中得到的混合液，進行ニ維液相-Q-Tof質(zhì)譜測定，進行定性和定量處理，得到微藻蛋白組分析結果。所述微藻為小球藻(Chlorellasorokiniana)、柵藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)及魚渥藻(Anabaena sp.PCC7120)。所述步驟(3) ニ維液相-Q-Tof質(zhì)譜的檢測條件為①ー維強陽離子交換柱分離色譜柱Z0RBAXBIO-SCX II 強陽離子交換柱，3. 5 μ m，35 X O. 3mm ；流動相體積比為95/5/0. I的水/こ腈/甲酸；流動相流速10μ L · mirT1 ；②ニ維C18柱分離色譜柱Z0RBAX300SB_C18trap 柱 5 μ m，5 X O. 3mm ;ZORBAX 300SB-C18 柱 3· 5 μ m，150mmX 75 μ m ;流動相配比流動相A :體積比為95/5/0. I的水/こ腈/甲酸；流動相B :體積比為95/5/0. I的こ臆/水/甲酸；流動相流速300nL· mirT1 ；③質(zhì)譜條件離子化方式正離子電噴霧模式；電壓1500V;離子源溫度150° C;掃描范圍70 2500m/z。本發(fā)明提供了ー種分析微藻蛋白組的手段，這種手段涉及細胞收集、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的分析，從而獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)的定性和定量結果，為微藻蛋白組的分析提供了方法，這種方法對促進微藻的蛋白組學研究具有重要的意義。


圖I 為四種不同接種密度(lX104cells/mL，lX105cells/mL，lX106cells/mL，lX107cells/mL)的小球藻培養(yǎng)體系蛋白表達量比較四種不同密度由低到高分別表示為IN104, IN105, IN106, IN107 ;以 I X 104cells/mL 的蛋白表達量為 I 進行比較。
具體實施例方式下面的實施例是為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明，并不對本發(fā)明作任何限制。下面通過具體實施例對本發(fā)明作進ー步的說明。實施例I—種微藻蛋白組的分析方法，包括如下步驟
(I)小球藻(Chlorella sorokiniana)細胞培養(yǎng)及收集對小球藻(Chlorella sorokiniana)進行四種不同細胞接種密度(IX IO4Cells/mL，lX105cells/mL，lX106cells/mL，lX107cells/mL，依次用 IN104, IN105, IN106, IN107表示)培養(yǎng)，當培養(yǎng)至0D560為0. 8時，取出已培養(yǎng)好的微藻藻液樣品，在3000rpm，4°C條件下離心3min，收集下層的細胞，用水清洗細胞后，在3000rpm，4°C條件下離心3min，收集下層的細胞在_80°C下冷凍干燥4h獲得凍干細胞；(2)提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì)①從上面四種凍干細胞中各取I份，每份50mg，分別置于離心管中，每管加入0. 5mL細胞裂解液，混勻，以每超聲8s，間歇5s的方法冰上間歇超聲破碎共40s ;加入5 μ L的質(zhì)量比為2:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應IOmin ;加入5yL80mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置Ih ;12000rpm離心25min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細胞裂解液為8M尿素,質(zhì)量濃度為4%的3_[ (3 —膽酰胺丙基)一二こ胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量為水；②測定蛋白濃度采用Bradford試劑盒，將標準牛血清蛋白溶液由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，配制成系列溶液，測定系列溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；按相同方法測定步驟①獲得的4份蛋白溶液蛋白的濃度；③沉淀蛋白分別取4份步驟②獲得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50 μ g蛋白，每份加入蛋白溶液體積4倍的-20°C的丙酮，沉淀12h ;離心，棄上清，沉淀用-20°C的體積濃度為70%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；-80°C貯存；④蛋白還原以及酶解向步驟③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10 μ L40mM的三こ基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；加入I μ L三(2-羧こ基)膦，在50°C反應lh，對各個蛋白進行還原化處理；然后加入I μ L甲基硫代磺酸甲酷，室溫反應lOmin，終止還原反應；加濃度為0. 2 μ g/μ L的胰蛋白酶水溶液20μ L，37°C反應12小時，進行蛋白酶解；⑤肽標記在每個蛋白酶解液中分別加入一管用60 μ Lこ醇溶解的iTRAQ標記試劑，室溫反應Ih ；⑥溶液混合將步驟⑤獲得的4份溶液混合成混合液，于_40°C保存；( 3 )差異表達蛋白鑒定將步驟(2)⑥中得到的混合液，進行ニ維液相-Q-Tof質(zhì)譜測定，進行定性和定量處理，得到微藻蛋白組分析結果。ニ維液相-Q-Tof質(zhì)譜的檢測條件為①ー維強陽離子交換柱分離色譜柱Z0RBAXBIO-SCX II 強陽離子交換柱，3. 5 μ m，35 X O. 3mm ；流動相體積比為95/5/0. I的水/こ腈/甲酸；流動相流速10μ L · mirT1 ；②ニ維C18柱分離色譜柱Z0RBAX300SB-C 18trap 柱 5 μ m，5 X O. 3mm ;ZORBAX 300SB-C18 柱 3· 5 μ m, 150mmX 75 μ m ；流動相配比流動相A :體積比為95/5/0. I的水/こ腈/甲酸；流動相B :體積比為95/5/0. I的こ臆/水/甲酸；流動相流速300nL· mirT1 ；③質(zhì)譜條件離子化方式正離子電噴霧模式；電壓1500V;離子源溫度150° C;掃描范圍7(T2500m/z。(4)實驗結果表I蛋白質(zhì)鑒定表
權利要求
1.一種微藻蛋白組的分析方法，其特征是包括如下步驟 (1)微藻細胞收集 取出已培養(yǎng)好的微藻藻液樣品，在3000-5000rpm,4°C條件下離心3_4min,收集下層的細胞，用水清洗細胞后，在3000-5000rpm，4°C條件下離心3_4min，收集下層的細胞在_80°C下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞； (2)提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì) ①從凍干細胞中取4份，每份50-100mg，分別置于離心管中，每管加入0.5-lmL細胞裂解液，混勻，以每超聲8-10s，間歇5-6s的方法冰上間歇超聲破碎共40-60s ;加入5_15 u L的質(zhì)量比為2-4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混勻，4 °C靜置反應10_30min ;力口 A 5-15uL80-120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4 °C靜置l_3h ; 12000-15000rpm離心25-40min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細胞裂解液為8M尿素，質(zhì)量濃度為4%的3-[(3 —膽酰胺丙基)一二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量為水； ②測定蛋白濃度 采用Bradford試劑盒，將標準牛血清蛋白溶液由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，配制成系列溶液，測定系列溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；按相同方法測定步驟①獲得的4份蛋白溶液蛋白的濃度； ③沉淀蛋白 分別取4份步驟②獲得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50-150 y g蛋白，每份加入蛋白溶液體積4-6倍的-20°C —40°C的丙酮，沉淀12-20h ;離心，棄上清，沉淀用_20°C —40°C的體積濃度為70%-85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；_80°C貯存； ④蛋白還原以及酶解 向步驟③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10-40 u L 40-60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白； 加入1-4 ii L三(2-羧乙基)膦，在50-60°C反應lh，對各個蛋白進行還原化處理；然后加入1-2 u L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應10-15min，終止還原反應；加濃度為0. 2-0. 3 u g/U L的胰蛋白酶水溶液20-30ii L，37°C反應12-18小時，進行蛋白酶解； ⑤肽標記 在每個蛋白酶解液中分別加入一管用60-80 u L乙醇溶解的iTRAQ標記試劑，室溫反應Ih ； ⑥溶液混合 將步驟⑤獲得的4份溶液混合成混合液，于-40°C保存； (3)差異表達蛋白鑒定 將步驟(2)⑥中得到的混合液，進行二維液相-Q-Tof質(zhì)譜測定，進行定性和定量處理，得到微藻蛋白組分析結果。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種分析微藻蛋白組的方法，其特征是所述微藻為小球藻(Chlorella sorokiniana)、柵藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystissp. PCC6803)及魚腥藻(Anabaena sp. PCC7120)。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種分析微藻蛋白組的方法，其特征是所述步驟(3)二維液 相-Q-Tof質(zhì)譜的檢測條件為①一維強陽離子交換柱分離 色譜柱ZORBAX BIO-SCX II 強陽離子交換柱，3. 5 y m，35 X 0. 3mm ； 流動相體積比為95/5/0. I的水/乙腈/甲酸； 流動相流速10 ii L mirT1 ； ②二維C18柱分離色譜柱Z0RBAX 300SB-C18trap 柱 5 y m，5 X 0. 3mm ;ZORBAX 300SB-C18 柱 3. 5 y m，150mmX 75 u m ； 流動相配比流動相A :體積比為95/5/0. I的水/乙腈/甲酸；流動相B :體積比為95/5/0. I的乙腈/水/甲酸; 流動相流速300nL mirT1 ； ③質(zhì)譜條件 離子化方式正離子電噴霧模式； 電壓1500V ； 離子源溫度150° C; 掃描范圍7(T2500m/z。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微藻蛋白組的分析方法，步驟為(1)微藻細胞收集；(2)提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì)(3)差異表達蛋白鑒定。本發(fā)明提供了一種分析微藻蛋白組的手段，這種手段涉及細胞收集、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的分析，從而獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)的定性和定量結果，為微藻蛋白組的分析提供了方法，這種方法對促進微藻的蛋白組學研究具有重要的意義。
文檔編號G01N30/88GK102707001SQ20121015913
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者元英進, 呂亞金, 陸姝歡, 馬倩 申請人:天津大學