專利名稱：截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16用作肝細胞癌標(biāo)志物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16作為肝細胞癌標(biāo)志物，在制備檢測肝細胞癌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。肝細胞癌惡性程度高，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，而且早期診斷較困難，往往延誤了最佳治療時期。我國是肝癌高發(fā)國家，每年約11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，且發(fā)病年齡構(gòu)成年輕化，毎年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌嚴(yán)重危害我國人民生命財產(chǎn)安全，并且是影響社會經(jīng)濟發(fā)展的ー個重要因素。肝癌的及早發(fā)現(xiàn)和確診對于提高患者的生存率至關(guān)重要，而目前廣泛采用檢測血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP)來確診HCC,其敏感性、特異性及準(zhǔn)確性均不理想，尤其對腫瘤直徑小于3cm的小肝癌患者，其敏感性及陽性率更低，僅分別為33% 65%和9.1% 26% (AFP>20ug / L)。近年來已有20余種的基因異常表達被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有夫，但已確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中的異常表達率并不高，肝癌的發(fā)病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關(guān)基因、尤其是肝癌高表達基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機制具有重要意義。因此，研究和開發(fā)在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質(zhì)具有重要意義，尋找新的在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質(zhì)也具有迫切需要性。而且，加大力度進行我國肝癌的基礎(chǔ)研究具有戰(zhàn)略意義，分離和鑒定新的肝癌相關(guān)基因是肝癌基礎(chǔ)研究中的前沿課題。截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16 (truncated retinoic acid induced protein16)的 NCBI 登錄號為 AAQ06676. 1，Swissprot 登錄號為 Q86V87, IPI 號為 IPI00654780. 2。截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16是維甲酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白分子，其結(jié)構(gòu)與功能目前尚未清楚。截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16最初是在維甲酸誘導(dǎo)細胞分化時分離出來的，而維甲酸具有抑制細胞増殖、促進細胞調(diào)亡和促進細胞分化的作用，已被應(yīng)用于急性淋巴細胞白血病、肺癌及肝癌等多種癌癥的治療(Okuno M, Kojima S, Matsushima-Nishiwaki R, TsurumiH，Muto Y，F(xiàn)riedman SLj Moriwaki H. Retinoids in cancer chemoprevention. Curr CancerDrug Targets. 2004;4:285-98)。因此，截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16很可能也參與一系列生理過程，在細胞增殖、分化、以及細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有研究中，僅由Wang等發(fā)現(xiàn)全長型維甲酸誘導(dǎo)蛋白RAI16在肝細胞再生中發(fā)揮重要作用(Wang G，Deng Jj Yang Jj Zheng JJj Wang HZj Hu Qj Zhang ZMj Chen Cj Wang Dj LiZP.Analysis on the protein structure and function of retinoic acid induced16. World J Gastroenterol. 2007;15:1342-1346)。此外，未發(fā)現(xiàn)其他關(guān)于截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16參與細胞功能，特別是癌癥、肝細胞癌的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的新用途。本發(fā)明通過免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在人類肝細胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(zhì)(在癌組織中下調(diào)表達)。本發(fā)明通過免疫組織化學(xué)實驗，驗證了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的確在肝細胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中下調(diào)表達)。本發(fā)明通過肝細胞癌組織芯片，對62對人肝細胞癌的癌組織與癌旁組織進行的免疫組織化學(xué)實驗，進ー步證實了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在人類肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中下調(diào)表達)?；诮囟绦途S甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16與肝細胞癌的這種相關(guān)性，本發(fā)明人認為tRAI16可以作為一種檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物，通過對它的表達量進行定性或定量檢測，用于檢測肝細胞癌。本發(fā)明的第一方面，提供了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16作為檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物的用途。本發(fā)明第二方面，還提供了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其中的腫瘤具體指肝細胞癌。所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，是以常規(guī)方法制備抗截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的抗體，建立檢測截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的試劑或試劑盒。所述的以常規(guī)方法制備抗截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的抗體，常規(guī)方法可以是指用外源表達的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16或化學(xué)合成的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16多肽作為抗原免疫實驗動物制備的抗體(參見《抗體制備與使用實驗指南》，科學(xué)出版社，2010年)。所述的抗截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。所述的檢測截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的試劑或試劑盒，具體是體外檢測肝組織中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的表達是否異常。體外檢測肝組織中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的表達是否異常，首先是檢測待測肝組織中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的表達量，其次是與正常肝組織中的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的表達量進行比較，最后判斷這種蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物在待測肝細胞組織中是否均存在下調(diào)表達。所述的試劑或試劑盒，可以是酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒、化學(xué)發(fā)光法試劑盒、固態(tài)或液態(tài)芯片試劑盒，或者根據(jù)抗體包被檢測抗原的方法制備的其他試劑盒。本發(fā)明第三方面，還提供了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體是指將待選藥物用于肝癌細胞，檢測截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的表達量是否回升。鑒于到目前為止，尚無有關(guān)截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16與肝細胞癌的任何相關(guān)性報道。因此，本發(fā)明的這ー發(fā)現(xiàn)將為肝細胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖I為肝細胞癌患者肝組織樣本中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的免疫印跡檢測結(jié)果，其中，P1-P18為肝細胞癌患者編號，T為肝細胞癌組織，N為對應(yīng)的癌旁組織。圖2為肝細胞癌患者肝組織樣本中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的免疫組織化、學(xué)實驗結(jié)果，其中，T為肝細胞癌組織，N為對應(yīng)的癌旁組織，物鏡放大倍數(shù)為20倍。圖3為肝細胞癌組織芯片中截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果，其中，A為高分化肝細胞癌，B為中分化肝細胞癌，C為低分化肝細胞癌"為肝細胞癌組織，N為對應(yīng)的癌旁組織，物鏡放大倍數(shù)為10倍。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作進ー步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照《分子克隆》中所述常規(guī)條件，或試劑制造廠商所建議的條件實施。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的溶液配方如下I、裂解液50mM Tris-鹽酸，150mM氯化鈉，1%NP_40，ImM正礬酸鈉，ImM氟化鈉，2. 5mM 焦磷酸鈉，ImM EDTA, pH 7. 4。2、？83:1501111氯化鈉，101111氯化鉀，81111磷酸氫ニ鈉，21111磷酸ニ氫鉀，？!1 7.4。3、TBST:50mM Tris-鹽酸，150mM 氯化鈉，IOmM 氯化鉀，O. 5%Tween-20, pH 7. 4。實施例I、肝細胞癌的癌組織和癌旁組織蛋白樣品的制備從東方肝膽外科醫(yī)院獲取18例肝細胞癌患者的癌組織及癌旁組織。該18例患者，均由2名病理科醫(yī)生確診，患有肝細胞癌，未經(jīng)化學(xué)藥物和放射性治療。18例患者的病理資料如表I所示。手術(shù)切除的新鮮組織塊立即置于冰上，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，在液氮中快速研磨成細胞沉淀，而后置于細胞裂解液中，4° C裂解30分鐘；在冰浴條件下，使用超聲細胞破碎儀間歇超聲破碎2分鐘后，4° C 13000g離心15分鐘，取上清采用改良Bredford法進行總蛋白定量。表I、18例肝細胞癌患者的病理資料
權(quán)利要求
1.截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16作為檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物的用途。
2.截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其中的腫瘤具體指肝細胞癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，是以常規(guī)方法制備抗截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的抗體，建立檢測截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的試劑或試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16的抗體，是單克隆抗體或多克隆抗體。
6.截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，肝癌的及早發(fā)現(xiàn)和確診對于提高患者的生存率至關(guān)重要，而目前廣泛采用檢測血清中甲胎蛋白來確診HCC，其敏感性、特異性及準(zhǔn)確性均不理想。本發(fā)明擬在尋找在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16可用作檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物，本發(fā)明還提供了截短型維甲酸誘導(dǎo)蛋白tRAI16在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明尋找到了新的在肝細胞癌中高表達的蛋白質(zhì)，為腫瘤的診斷和治療提供了新的途徑。
文檔編號G01N33/532GK102735831SQ20121016263
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者任浩, 戚中田, 王巖, 王文, 趙蘭娟 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)