專利名稱：一種檢測苯甲酸雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種檢測苯甲酸雌ニ醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2008年的三聚氰胺事件，使三鹿集團倒閉，我國乳品企業(yè)重新洗牌，使人們對牛奶及其制品質(zhì)量安全問題愈發(fā)關(guān)注。2010年8月某奶粉疑致女嬰性早熟的激素門事件又將乳制品推上了風(fēng)ロ浪尖。牛奶中是否有雌激素的存在和奶牛產(chǎn)奶數(shù)量是否受到雌激素的作用是目前人民大眾急需了解的內(nèi)容。無論是進ロ奶源，還是國內(nèi)奶源，均有殘留激素的隱患。 奶業(yè)和食品營養(yǎng)專家指出，奶牛吃的飼料或草料含有激素的可能性最大，在奶粉業(yè)這是ー種隱形的存在；此外，在奶牛飼養(yǎng)中使用的催產(chǎn)素、催奶素等，也可能導(dǎo)致激素殘留。尤其近年來由于過量使用外源性性激素作為動物飼料添加劑和植物生長調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致大量食品中污染了性激素類物質(zhì)。這些雌激素殘留，通過食物鏈在人體內(nèi)積累，可誘發(fā)癌變，對生殖與神經(jīng)等系統(tǒng)帶來影響，還造成嚴重的環(huán)境問題。雖然國家在2008年制定了《乳品質(zhì)量安全監(jiān)瞀管理條例》，要求加強奶畜養(yǎng)殖、生鮮乳收購、乳品生產(chǎn)、經(jīng)營、進ロ等各環(huán)節(jié)的監(jiān)瞀檢查，明確規(guī)定禁止銷售、收購和加工尚處于用藥期和休藥期內(nèi)的奶畜產(chǎn)，不符合健康標準或者沒有經(jīng)過檢疫合格的奶畜產(chǎn)的，以及不合法規(guī)標準的生鮮乳，從源頭上控制生鮮乳的獸藥殘留。但是目前雌激素的檢測尚未列入國標中，乳制品企業(yè)也未將其作為生鮮乳收購的檢測項目，因此尚不能從源頭上消除雌激素的隱患。要減小雌激素污染對食品安全和人體健康造成的威脅，必須加強市場監(jiān)管，完善檢測手段。而乳制品中雌激素的殘留量一般較少，常規(guī)測定方法的應(yīng)用受到限制，需要比較靈敏的檢測方法。目前苯甲酸雌ニ醇的檢測方法主要使用大型儀器，如HPLC、GC-MS、LC-MS等。但由于儀器設(shè)備價格昂貴，操作復(fù)雜、費時，不適用于大批量樣品的快速檢測，因此不能用于大批量樣品的現(xiàn)場快速篩查，不能在基層單位和企業(yè)得到推廣。而酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法，由于其特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測速度快，特別適于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。目前在真菌毒素、藻毒素等的快速檢測中ELISA法已經(jīng)是最常用的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測苯甲酸雌ニ醇的酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于對食品中苯甲酸雌ニ醇的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案該檢測苯甲酸雌ニ醇的試劑盒是由(1)96或48孔包被板，(2)苯甲酸雌ニ醇標準品，(3)苯甲酸雌ニ醇的單抗凍干品，(4)酶標記的羊抗鼠抗體凍干品，
(5)洗滌液，(6)顯色液A，(7)顯色液B，(8)終止液所組成。所述的酶標記的羊抗鼠抗體凍干品為HRP-羊抗鼠抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCl緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫ニ鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯(lián)苯ニ胺的こ醇水溶液，終止液為硫酸溶液。本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)來檢測苯甲酸雌ニ醇。采用ELISA的技術(shù)主要有兩個方面第一，特異性單克隆抗體的制備，利用抗原免疫小鼠，經(jīng)細胞融合、選擇培養(yǎng)、腹腔注射，經(jīng)培養(yǎng)后抽取腹水，得到抗苯甲酸雌ニ醇的單克隆抗體；第二，苯甲酸雌ニ醇-ELISA試劑盒的制備。檢測苯甲酸雌ニ醇的酶聯(lián)免疫分析試劑盒的制備詳見實施例I和2。苯甲酸雌ニ醇的測定方法為取包被有苯甲酸雌ニ醇與載體蛋白偶聯(lián)物的微孔包被板，加入苯甲酸雌ニ醇標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌ニ醇抗體， 振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的苯甲酸雌ニ醇含量。本發(fā)明的有益效果該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，檢測限可達10ng/mL，特別適于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。


圖I為苯甲酸雌ニ醇酶聯(lián)免疫分析法的標準曲線。
具體實施例方式提供以下實施例是為了更好地理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成任何限制。實施例I抗苯甲酸雌ニ醇的單克隆抗體的制備苯甲酸雌ニ醇是典型的半抗原，在免疫反應(yīng)中只具有反應(yīng)原性，需與大分子物質(zhì)結(jié)合后才有免疫原性。我們采用多元酸酐法活化苯甲酸雌ニ醇，用混合酸酐法將活化的苯甲酸雌ニ醇與載體蛋白(KLH，BSA)偶聯(lián)，制備了免疫抗原苯甲酸雌ニ醇-KLH和包被抗原苯甲酸雌ニ醇-BSA。以合成的苯甲酸雌ニ醇-KLH作為人工合成的免疫抗原進行動物免疫，制備抗體。I.苯甲酸雌ニ醇-KLH和苯甲酸雌ニ醇-BSA抗原的制備稱取苯甲酸雌ニ醇75. 2mg (約O. 2mmol),加入4mL含22. 8mg (約O. 2mmol)戍ニ酸酐的吡啶溶液中，室溫攪拌反應(yīng)22h。反應(yīng)完成后，氮氣吹干吡啶。殘留物用8mL溶劑(DMF和1，4_ ニ噁烷I : I混合)溶解，加入O. 0524mL (約O. 2mmol)正三丁胺，冰中攪拌lOmin，加入氯甲酸異丁酯O. 0288mL (約O. 2mmol)，室溫攪拌反應(yīng)lh。將活化的苯甲酸雌ニ醇溶液逐滴加入10mL、0. lmol/L pH 8. 5冰冷載體蛋白硼酸鈉溶液中，Ih內(nèi)加完，室溫攪拌反應(yīng)過夜。載體用量BSA 50mg, KLH IOOmgo偶聯(lián)物過S印hadex G-25層析柱提純。用紫外吸收法測定載體濃度作為偶聯(lián)物濃度。提純的偶聯(lián)物于_20°C保存。2.抗苯甲酸雌ニ醇單克隆抗體的制備將免疫抗原苯甲酸雌ニ醇-KLH與等量的福氏完全佐劑乳化，以皮下多點及腹腔注射途徑對8周齡左右的BalB/c雌性小鼠進行基礎(chǔ)免疫。間隔14天后，改為福氏不完全佐劑追加免疫，14天后再免疫一次。檢測多抗效價達到I : 2000后，經(jīng)尾靜脈用水劑抗原加強免疫一次，3 4天后處死取出小鼠脾臟，得到脾細胞進行細胞融合。毎次免疫抗原用量為每只鼠O. 025 O. 05mg。得到的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞(Sp2/0)以8 I混合，用聚こニ醇(PEG，麗4000)作融合劑。融合細胞懸于含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液內(nèi)，分別于加有BalB/c小鼠腹腔滲出細胞作滋養(yǎng)層的96孔細胞培養(yǎng)板中，置6% CO2中在37°C培養(yǎng)。以苯甲酸雌ニ醇-BSA為包被抗原，用iELISA法對上清液中雜交瘤進行篩選，并用icELISA法確證。對檢出的陽性克隆孔采用有限稀釋法進行亞克隆。置6% CO2中在37°C繼續(xù)培養(yǎng)，直至所有細胞生長孔的培養(yǎng)液均呈陽性為止。當(dāng)連續(xù)3次100%陽性時，即可進行單抗的擴大培養(yǎng)。采用小鼠腹腔內(nèi)誘生單克隆抗體的方法進行擴大培養(yǎng)。取成年的BalB/c小鼠，于腹腔內(nèi)注入液體石蠟O. 5mL, I周后于腹腔內(nèi)注入雜交瘤細胞。用生理鹽水將雜交瘤細胞懸浮混勻，并將細胞數(shù)調(diào)至4 X IO5個/mL，每只BalB/c小鼠腹腔注射O. 5mL雜交瘤細胞。10 14天后收集腹水。iELISA法檢測腹水效價，測定結(jié)果顯示，腹水效價為6400，ELISA最適工作濃度為單抗稀釋4000倍。稀釋至工作濃度后分裝凍干，于-20°C長期凍存。實施例2 96孔ELISA試劑盒的制備I.包被板固相抗原制備將苯甲酸雌ニ醇-BSA用 50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9. 6 緩沖液稀釋至 10mg/L 的包被液，96孔微孔板各孔加O. ImL, 4°C放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，每孔加O. 15mL含3g/L BSA的上述緩沖液封閉，4°C放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20°C冷凍保存。2.試劑的配制(I)標準品苯甲酸雌ニ醇0ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 40ng/mL, 80ng/mL, 2OOng/mL，從苯甲酸雌ニ醇純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇水體積比為I : 9。(2)抗苯甲酸雌ニ醇抗體凍干品的制備見實施例I。(3) HRP標記的羊抗鼠抗體凍干品(HRP-羊抗鼠抗體)市售。(4)洗漆液14. Smmol /T, NaCl、0. 2mL/L Tween-80 和 O. 2 % NaN3 的 SOmmoI /I,Tris-HCl ρΗ7·8。(5)顯色液 A 0. 2MNa2HP04 25. 7mL, O. IM 檸檬酸 24. 3mL 和 O. 04% 的 H2O2 50mL。(6)顯色液B :稱取20mg四甲基聯(lián)苯ニ胺(TMB)加入IOmL無水酒精中，可加熱至37°C 40°C直到TMB完全溶解，加去離子水至lOOmL。(7)終止液2mol/L 的 H2SO4。3.試劑盒的組成⑴96孔板(8條X 12孔，可以拆分為單孔)，包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA。(2)苯甲酸雌ニ醇標準液，6瓶，O. 5mL/瓶，標準液濃度為0、10、20、40、80、200ng/mL。(3)苯甲酸雌ニ醇抗體凍干品，I瓶，用時6mL蒸餾水溶解。(4)HRP-羊抗鼠抗體凍干品，I瓶，用時12mL蒸餾水溶解。(5)洗滌液，I瓶，10mL，用時以蒸餾水I : 25稀釋。(6)顯色液 A, I 瓶,6mL。
(7)顯色液 B，I 瓶，6mL。(8)終止液，I 瓶，6mL。實施例3牛奶及乳粉樣品中苯甲酸雌ニ醇的檢測I.樣品前處理量取5mL牛奶樣品于小燒杯中，加20mL石油醚,將樣品移于125mL分液漏斗中，準確移取15mL提取液(甲醇水為I : I)分次洗小燒杯，洗液一井移入分液漏斗中，振搖5min,靜置分層后，放出下層提取液層，再準確移取5mL提取液重復(fù)振搖提取一次，合井下層提取液層。取2mL提取液(提取液如果不清澈需過膜)，加水SmL搖勻即為待測液。乳粉樣品水溶后前處理同牛奶。 2. ELISA 操作ELISA試劑盒的制備見實施例2。取苯甲酸雌ニ醇-BSA板條室溫下放置lOmin。每孔加O. 25mL洗滌液洗二次，拍干。加入O. 05mL的苯甲酸雌ニ醇標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。加O. 05mL苯甲酸雌ニ醇抗體，移液器管尖不要接觸到孔中的液體。37°C下暗處靜置30min后，甩掉反應(yīng)液，洗滌液洗三次，拍干。每孔加O. ImLHRP-羊抗鼠抗體，37°C下暗處靜置30min后，甩掉反應(yīng)液，洗滌液洗三次，拍干。每孔加O. 05mL顯色液A和
O.05mL顯色液B，暗處靜置15min后，每孔加O. 05mL終止液測量吸光度值，從標準曲線計算樣品中的苯甲酸雌ニ醇含量。3.結(jié)果計算(I)定量苯甲酸雌ニ醇標準溶液濃度為0、10、20、40、80、200ng/mL，用酶標儀(450nm)測得
每孔的吸光度值(A)，繪制標準曲線。通過標準曲線，可準確定量樣品中苯甲酸雌ニ醇含量。標準曲線用坐標紙進行繪制，橫坐標為苯甲酸雌ニ醇標準溶液濃度的對數(shù)，縱坐標為百分比，即各標準品孔和樣品孔吸光度值除以O(shè)ng/mL標準品孔吸光度值(AO)再乘以100%所得。相應(yīng)每個樣品的苯甲酸雌ニ醇濃度可從曲線上獲得，乘以樣品稀釋倍數(shù)可計算樣品中苯甲酸雌ニ醇含量。有計算機軟件可對ELSIA數(shù)據(jù)進行處理，特別適用于大量數(shù)據(jù)的處理。用免疫測定軟件Ridasoft Win所得標準曲線見附圖I。(2)半定量半定量的結(jié)果可通過對比樣品與某一標樣孔的顏色獲得樣品的顔色比標樣孔的顔色淺則苯甲酸雌ニ醇的濃度比標樣孔的濃度高，樣品的顔色比標樣孔的顔色深則苯甲酸雌ニ醇的濃度比標樣孔的濃度低?？筛鶕?jù)質(zhì)控限直接判定是否為陽性，無需儀器測定吸光度值和數(shù)據(jù)計算。
權(quán)利要求
1.一種檢測苯甲酸雌ニ醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括96或48孔包被板(1)，苯甲酸雌ニ醇標準品(2)，抗苯甲酸雌ニ醇的單抗凍干品(3)，酶標記的羊抗鼠抗體凍干品(4)，洗滌液(5)，顯色液A (6)，顯色液B (7)和終止液(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記的羊抗鼠抗體凍干品為HRP-羊抗鼠抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCl緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫ニ鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯(lián)苯ニ胺的こ醇水溶液，終止液為硫酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在干所述的包被板(I)包被固相抗原苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA ;用50mmol/L pH9. 6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液將苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA稀釋至10mg/L做為包被液,96或48孔微孔板姆孔加O. ImL包被液,4°C放置過夜,棄去包被液，沖洗三次，每孔加 O. 15mL 含 3g/L BSA 或 KLH 或 OVA 的 50mmol/L pH9. 6 的 Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，4°C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20°C冷凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在干所述的苯甲酸雌ニ醇標準品(2)，共6瓶，濃度分別為0ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 40ng/mL, 80ng/mL, 200ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的抗苯甲酸雌ニ醇的單抗凍干品(3)，為抗苯甲酸雌ニ醇的單克隆抗體的凍干品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗苯甲酸雌ニ醇的單克隆抗體，其制備方法如下將苯甲酸雌ニ醇和BSA或KLH或OVA偶聯(lián)作為抗原，免疫雌性BalB/c小鼠，檢測多抗效價達到I 2000后，在PEG-4000作用下將免疫的小鼠脾細胞與Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)過HAT選擇培養(yǎng)，用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清，對檢出的陽性克隆孔采用有限稀釋法進行亞克隆，雌性小鼠BalB/c腹腔注射液體石蠟、雜交瘤細胞，經(jīng)培養(yǎng)后抽取腹水，腹水中即含有抗苯甲酸雌ニ醇的特異性單克隆抗體。
7.一種用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測苯甲酸雌ニ醇的方法，其特征在于取包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA的微孔包被板，加入苯甲酸雌ニ醇標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌ニ醇抗體，暗處靜置反應(yīng)，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度值，對照標準曲線計算樣品中的苯甲酸雌ニ醇含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測苯甲酸雌ニ醇的方法，其操作為樣品前處理；取包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA的微孔包被板，加入O. 05mL的苯甲酸雌ニ醇標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，加O. 05mL抗苯甲酸雌ニ醇抗體，37°C暗處靜置30min，洗滌液洗三次，加O. ImL酶標記的羊抗鼠抗體，37°C暗處靜置30min， 用洗滌液洗三次，加O. 05mL顯色液A和O. 05L顯色液B，暗處靜置15min后加終止液，在450nm處測吸光度值，從標準曲線計算樣品中的苯甲酸雌ニ醇含量。
全文摘要
一種檢測苯甲酸雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本試劑盒采用特異性強的抗苯甲酸雌二醇單克隆抗體。微孔板包被有苯甲酸雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物，加入苯甲酸雌二醇標準品或樣品，再加入苯甲酸雌二醇單抗。游離的苯甲酸雌二醇與微孔板上的苯甲酸雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物競爭苯甲酸雌二醇單抗，沒有連接的苯甲酸雌二醇單抗被洗滌除去，加入HRP-羊抗鼠抗體，標記免疫反應(yīng)后沒有連接的HRP-羊抗鼠抗體被洗滌除去。加顯色液、終止液后，用酶標儀測定其吸光度，吸光度的值與樣品中的苯甲酸雌二醇濃度成反相關(guān)，對照標準曲線即可確定被測樣品中苯甲酸雌二醇的含量。本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、廉價、靈敏度高，檢測限可達10ng/mL，主要用于大批樣品的現(xiàn)場快速篩查。
文檔編號G01N33/531GK102721811SQ20121016728
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者呂春霞, 張曉偉, 王加華, 王德國, 肖付剛 申請人:許昌學(xué)院