專利名稱：一種結(jié)核病抗原特異的全血t細(xì)胞檢測方法
—種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法本發(fā)明涉及結(jié)核桿菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是ー種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Macobacteriumtubercuolosis)感染所導(dǎo)致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，迄今仍是全球范圍內(nèi)単一病原體引起死亡人數(shù)最多的傳染性疾病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會問題，也是我國把重點控制的主要疾病之一。結(jié)核分枝桿菌感染后約10%會發(fā)展為活動性結(jié)核，而大部分成為無癥狀感染者。即使初始的結(jié)核感染被成功控制后，一些細(xì)菌仍然以不增殖或者低增殖水平的休眠狀態(tài)存在于宿主體內(nèi)， 這種感染狀態(tài)稱為結(jié)核潛伏感染，無臨床癥狀。無癥狀感染者在免疫能力低下時(免疫系統(tǒng)發(fā)育不全、衰退、或免疫抑制等)則較易發(fā)展成活動性結(jié)核，是隱形感染者中的高危人群。因此，能否早期、準(zhǔn)確地檢測活動性結(jié)核病以及潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosisinfection LTBI)的病患，將極大地影響著全球結(jié)核病預(yù)防控制的效果。因此,尋■求快速、簡便、有效、廉價的檢測方法很有實際意義。臨床上常用的輔助結(jié)核病檢測的方法，結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test, TST)就是利用檢測結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞免疫功能的方法，所需費用較少，簡單易行，用于結(jié)核病的檢測的歷史已超過100年。但是，TST所應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌純化的蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin)PPD是分枝桿菌培養(yǎng)液中200多種成分的混合物，這種蛋白混合物是結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG和大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌所共有，因而缺乏特異性。當(dāng)直接檢測結(jié)核分枝桿菌病原體、結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)抗體的靈敏度特異性仍然不能滿足結(jié)核病檢測的要求吋，科學(xué)家們想通過間接的辦法來檢測結(jié)核分枝桿菌的感染。結(jié)核分枝菌感染的免疫反應(yīng)主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，機體感染結(jié)核分枝桿菌后會產(chǎn)生特異性致敏T淋巴細(xì)胞，利用此T淋巴細(xì)胞在體外激活能產(chǎn)生一系列效應(yīng)過程的原理，來檢驗個體是否感染過結(jié)核分枝桿菌。近100年來，在結(jié)核病檢測方面最為重要的進展之一是基于IFN- Y的檢測分祈。這個方法的原理是當(dāng)特異性的致敏T淋巴細(xì)胞再次接觸相同的抗原時便被激活而分泌IFN- Y，通過檢測IFN- Y的量而進行檢測。1991年，Wood等最早使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或酶聯(lián)免疫斑點法(Enzyme-linked immunospot assay, ELISP0T)在體外檢測特異性T淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y的量，從而對農(nóng)場的13091頭牛進行了檢查，檢測的敏感性為76. 89Γ93. 6%，特異性為96. 2% 98. 1%，靈敏度高于TST65. 6%。但該方法仍然有如下二方面不足一是檢測周期過長，需要兩天時間，ニ是操作繁瑣，對操作人員和操作環(huán)境要求很高，不適于基層推廣。本發(fā)明是針對上述檢測方法的困難和不足之處，提出一種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計ー種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于將結(jié)核桿菌特異抗原表位肽，MHC供體和受檢者的外周全血孵育，直接檢測MHC供體-結(jié)核分枝桿菌抗原表位-特異性T細(xì)胞形成的復(fù)合物的信號。該應(yīng)用方法包括以下步驟，a.對所述的結(jié)核桿菌特異抗原表位肽進行標(biāo)記，并與MHC供體孵育制備標(biāo)記表位肽-MHC供體復(fù)合物；采集受檢者的外周靜脈血樣本；b.用步驟(a)得到的復(fù)合物刺激外周靜脈血中的T淋巴細(xì)胞，37°C度培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng) O. 5-16h, c.收集培養(yǎng)T細(xì)胞，d.檢測MHC供體-結(jié)核分枝桿菌抗原表位-特異性T細(xì)胞形成的復(fù)合物的信號。該特異抗原表位具有結(jié)核分枝桿菌特異性，包含且不限于ー種或幾種結(jié)核桿菌特異抗原所含的表位。所述的結(jié)核桿菌抗原來源的細(xì)菌菌種僅限于結(jié)核分枝桿菌的不同型別及由這些型別衍生的細(xì)菌菌株。所述的結(jié)核桿菌特異抗原是天然抗原、重組抗原或肽及其它可能用于識別結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞受體的物質(zhì)。所述的結(jié)核桿菌抗原是抗原本身或抗原綴合物或衍生物。所述的MHC供體包括且不限于天然含MHC的細(xì)胞，人工構(gòu)建的MHC單體、MHC ニ聚體、MHC四聚體。所述的復(fù)合物信號檢測包括且不限于通過表位肽標(biāo)記物、TCR標(biāo)記物及其它可用于抗原特異性TCR識別檢測的標(biāo)記物、⑶3的標(biāo)記。本發(fā)明可實現(xiàn)對結(jié)核病病人和感染者早期、快速、特異的檢測，整個檢測2-3小時即可完成，對操作人員和操作環(huán)境要求較低，特別是無須在無菌環(huán)境下手動操作和自動化操作。本發(fā)明提出的結(jié)核病抗原特異的全血TCR檢測具有以下優(yōu)勢一是檢測需要的時間短，較為快速，共需要2-4小吋。而結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測需時間1-2月，TST檢測需要3天。ELISP0T方法需要2天。由于結(jié)核桿菌一旦感染人體，首先就會被機體的免疫系統(tǒng)所識別，激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)生時間在感染后1-2個月，因此利用我們的細(xì)胞免疫學(xué)檢測方法即可作出檢測。X光片檢測只有在感染者肺部出現(xiàn)明顯的病理改變后才可作出檢測，這通常需要很長的時間?？乖贵w檢測法也只有在疾病癥狀處于活動期的情況下檢測，但環(huán)境中分枝桿菌廣泛存在，其與結(jié)核桿菌的共同抗原，可干擾實驗的檢測結(jié)果。ニ是特異檢測，由于采用的是結(jié)核桿菌特異性的抗原，只與結(jié)核桿菌感染人體后產(chǎn)生的免疫記憶T細(xì)胞被識別。三是敏感性高，與TST檢測相比，結(jié)核病抗原特異的TCR檢測檢測的敏感性為97. 2%，特異性高達(dá)92. 3%，具有良好的檢測符合率(k = 0. 70)。因此，本發(fā)明提出結(jié)核病抗原特異的全血TCR檢測試劑及其應(yīng)用方法，對結(jié)核病的控制和消滅具有重要意義。下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍，本專利涉及表位肽包括且不限于下表中表位肽。下列實施例中未注明具體的實施方法，通常是按照實驗室技術(shù)常規(guī)或市場公開銷售的試劑盒的說明書進行。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，首先會被人體的免疫系統(tǒng)識別，激活機體的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗結(jié)核感染作用。部分T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為免疫記憶細(xì)胞，當(dāng)再次與結(jié)核桿菌抗原表位肽相遇后，被特異性TCR識別。因此如果采用結(jié)核桿菌特異的抗原在體外被感染者和患者的T細(xì)胞識別，而非結(jié)核桿菌感染者或非結(jié)核病患者T細(xì)胞不能被識別，從而實現(xiàn)檢測的目的。實施例中涉及表位肽組合如下表所示
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于將結(jié)核桿菌特異抗原表位肽，MHC供體和受檢者的外周全血孵育，直接檢測MHC供體-結(jié)核分枝桿菌抗原表位-特異性T細(xì)胞形成的復(fù)合物的信號。
2.如權(quán)利要求I所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于該應(yīng)用方法包括以下步驟， a.對所述的結(jié)核桿菌特異抗原表位肽進行標(biāo)記，并與MHC供體孵育制備標(biāo)記表位肽-MHC供體復(fù)合物；采集受檢者的外周靜脈血樣本； b.用步驟(a)得到的復(fù)合物刺激外周靜脈血中的T淋巴細(xì)胞，37°C度培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)0.5-16h, c.收集培養(yǎng)T細(xì)胞， d.檢測MHC供體-結(jié)核分枝桿菌抗原表位-特異性T細(xì)胞形成的復(fù)合物的信號。
3.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于該特異抗原表位具有結(jié)核分枝桿菌特異性，包含且不限于一種或幾種結(jié)核桿菌特異抗原所含的表位。
4.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于所述的結(jié)核桿菌抗原來源的細(xì)菌菌種僅限于結(jié)核分枝桿菌的不同型別及由這些型別衍生的細(xì)菌菌株。
5.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于所述的結(jié)核桿菌特異抗原是天然抗原、重組抗原或肽及其它可能用于識別結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞受體的物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于所述的結(jié)核桿菌抗原是抗原本身或抗原綴合物或衍生物。
7.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于所述的MHC供體包括且不限于天然含MHC的細(xì)胞，人工構(gòu)建的MHC單體、MHC 二聚體、MHC四聚體。
8.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，其特征在于所述的復(fù)合物信號檢測包括且不限于通過表位肽標(biāo)記物、TCR標(biāo)記物及其它可用于抗原特異性TCR識別檢測的標(biāo)記物、⑶3的標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)核桿菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種結(jié)核病抗原特異的全血T細(xì)胞檢測方法，將結(jié)核桿菌特異抗原表位肽，MHC供體和受檢者的外周全血孵育，直接檢測MHC供體-結(jié)核分枝桿菌抗原表位-特異性T細(xì)胞形成的復(fù)合物的信號。本發(fā)明可實現(xiàn)對結(jié)核病病人和感染者早期、快速、特異的檢測，整個檢測2-3小時即可完成，多操作人員和操作環(huán)境要求較低，特別是無須在無菌環(huán)境下手動操作和自動化操作。
文檔編號G01N33/569GK102680684SQ20121018364
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者孫戰(zhàn)強, 張舒林, 李榮秀 申請人:孫戰(zhàn)強, 張舒林, 李榮秀