專利名稱：一種dna生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石墨烯薄膜DNA生物傳感器及制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，國內(nèi)外有關(guān)DNA傳感器的研究十分活躍，正成為生物傳感器技術(shù)的研究熱點(diǎn)，DNA傳感器以其簡易、快捷、價廉的獨(dú)特優(yōu)越性，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。DNA生物傳感器依據(jù)DNA分子之間或DNA分子與其它物質(zhì)的 相互作用(雜化作用)所引起的各種變化來記錄、分析發(fā)生在傳感器和探測目標(biāo)之間的雜化反應(yīng)，以完成對目標(biāo)物的探測和監(jiān)控。其是以核酸作為分子識別元件，將目標(biāo)物的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的電、光、聲等信號。石墨烯是一種有一層或幾層原子厚度的純碳原子結(jié)構(gòu)，其C-C鍵以Sp2結(jié)合，形成一個密集的蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)；目前，以石墨烯為基礎(chǔ)的材料已經(jīng)引起了科學(xué)界的廣泛興趣。Alwarappan等(Subbiah Alwarappan, etal, ASAP, 2009)發(fā)現(xiàn)石墨烯基生物傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性比單壁碳納米管高，預(yù)示著石墨烯作為新一代的生物傳感材料具有很大的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DNA生物傳感器的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 DNA生物傳感器的制備方法，包括以下步驟I)生物傳感器的硅片基底自組裝上石墨烯薄膜首先將硅片置于2_5ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡12_14h ；其次，取出硅片用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?；完成硅片與十八烷基三甲氧基硅烷的自組裝；把自組裝后的硅片放入石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈桑瓿墒┑淖越M裝；2)生物傳感器的金膜基底自組裝上石墨烯薄膜首先將金膜置于2_5ml的標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3_5h ;其次，取出金膜用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，完成金膜與標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇的自組裝；把自組裝后的金膜放入石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝；3) DNA的固定及雜交將自組裝過石墨烯的硅片和金膜放入2_5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡
5-7h ;取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成十八烷基胺與石墨烯之間的自組裝；將自組裝過十八烷基胺的硅片和金膜依次在Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分別浸泡24h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成DNA的固定與雜交。所述的十八烷基三甲氧基硅烷溶液為乙醇配制的濃度為0. 01mg/ml。
所述的I-十八硫醇溶液的濃度為0. 28mg/mloDNA生物傳感器的制備過程中所述的石墨烯懸浮液和步驟3)中所述的十八烷基胺溶液的濃度均為0. lmg/mlDNA生物傳感器的制備過程中所述的步驟3)中所述的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液的濃度均為I U mol/L。本發(fā)明設(shè)計(jì)并組裝了具有功能性的石墨烯薄膜，并制作了 DNA生物傳感器，通過電化學(xué)交流阻抗(EIS)和循環(huán)伏安(CV)電性能測試，自組裝前后及DNA固定雜交前后電性能有明顯的變化(如圖Ia和圖lb)，通過X射線光電子能譜(XPS)分析，在自組裝過程及DNA的固定與雜交過程，元素組成與結(jié)構(gòu)都有明顯的變化(如圖2);隨后，又研究了隨著目標(biāo)DNA濃度的變化，其雜交前后電化學(xué)性能的變化，通過差分脈沖伏安法(DPV)電性能測試，明顯觀察到目標(biāo)DNA濃度的變化對其峰值的影響(如圖3和圖4)。
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本發(fā)明這種新型DNA生物傳感器在DNA生物傳感器及DNA檢測上有很大的應(yīng)用前
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圖I為石墨烯的拉曼光譜圖；由圖可知，拉曼峰在l348cm 1 (D 峰)，1583cm 1 (G 峰)，2671cm 1 (2D 峰),sgMcnrHD+G峰)都有明顯的吸收，可以確定合成了石墨烯；圖2為石墨烯的(a) SEM圖和(b) TEM圖；圖2(a)為石墨烯的SEM圖，由圖可知，石墨烯卷曲如同弄皺的紙張一樣，表面光滑，成二維碳納米結(jié)構(gòu)，石墨烯在邊緣處有褶皺，存在一定的缺陷，不是理想狀態(tài)中的平整形貌。圖2 (b)是石墨稀的TEM圖，由圖可知,整體上石墨稀形貌是卷曲的片狀，出現(xiàn)裙皺起伏的片層結(jié)構(gòu)，這與石墨烯的SEM圖以及Raman光譜圖的分析吻合；圖3為DNA在組裝有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后各種元素的XPS圖譜；DNA在組裝有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后元素C Is,N Is和P 2p的XPS圖譜，DNA在組裝有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后各種元素的XPS圖譜。從圖3(a)和(b)中可以看出，十八烷基胺中單層膜具有強(qiáng)烈的C Is和N Is信號，而DNA固定后，除掉十八烷基胺和DNA中的C Is和N Is信號外，還出現(xiàn)了明顯的P 2p信號，這說明DNA分子固定到在十八烷基胺表面。在緩沖溶液中，由于Pl鏈上的負(fù)電荷與共聚物分子鏈上的正電荷之間存在靜電吸引力，使Pl能夠固定在導(dǎo)電聚合物膜上；圖4為各種分子在硅片上的自組裝過程以及DNA在自組裝薄膜上固定和雜交過程中的電化學(xué)交流圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合的實(shí)施例以作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I一種DNA生物傳感器的制備方法，其具體的技術(shù)方案如下I)生物傳感器的硅片基底自組裝上石墨烯薄膜首先，將硅片置于2ml用乙醇配制0.01mg/ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡12h ;取出硅片用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?；完成硅片與十八烷基三甲氧基硅烷的自組裝；把自組裝后的硅片放入濃度為0. lmg/ml的石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡2h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝。2)生物傳感器的金膜基底自組裝上石墨烯薄膜首先，將金膜置于2ml的濃度為0. 28mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)1_十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3h ;取出金膜用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈桑瓿山鹉づc標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇的自組裝；把自組裝后的金膜放入濃度為0. lmg/ml的石墨烯 懸浮液中，避光密封浸泡2h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝。 3) DNA探針的固定及靶向DNA與DNA探針的雜交將自組裝過石墨烯的硅片和金膜放入2ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡5h ；取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成十八烷基胺與石墨烯之間的自組裝；將自組裝過十八烷基胺的硅片和金膜依次在濃度均為I U mol/L的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分別浸泡24h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成DNA的固定與雜交。實(shí)施例2一種DNA生物傳感器的制備方法，其具體的技術(shù)方案如下I)生物傳感器的硅片基底自組裝上石墨烯薄膜首先，將硅片置于5ml用乙醇配制0.01mg/ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡14h ;取出硅片用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈桑煌瓿晒杵c十八烷基三甲氧基硅烷的自組裝；把自組裝后的硅片放入濃度為0. lmg/ml的石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡4h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝。2)生物傳感器的金膜基底自組裝上石墨烯薄膜首先，將金膜置于5ml的濃度為0. 28mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡4h ;取出金膜用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，完成金膜與標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇的自組裝；把自組裝后的金膜放入濃度為0. lmg/ml的石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡3h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝。3 ) DNA探針的固定及靶向DNA與DNA探針的雜交將自組裝過石墨烯的硅片和金膜放入5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡6h ；取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成十八烷基胺與石墨烯之間的自組裝；將自組裝過十八烷基胺的硅片和金膜依次在濃度均為I U mol/L的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分別浸泡24h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈桑瓿蒁NA的固定與雜交。圖 4(a)中的 i)Si、ii)Si+Ttos、iii) Si+Ttos+G 和 iv) Si+Ttos+G+C18NH2 和(b)中的 i)Si+Ttos+G+C18NH2、ii) Si+Ttos+G+C18NH2+Probe DNA, iii) Si+Ttos+G+C18NH2+ProbeDNA+TMM 和 iv) Si+Ttos+G+C18NH2+Probe DNA+TMM+MM0.為整個組裝和 DNA 在組裝薄膜上的固定和雜交的電化學(xué)交流阻抗圖。從圖4(a)中可以看出，石墨烯具有優(yōu)異的電性能，隨著石墨烯的進(jìn)一步組裝，其表面電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)和硅片比起來有所降低，其大小降至55. 7KQ，說明石墨烯的組裝又增強(qiáng)了電荷的轉(zhuǎn)移率。然后是自組裝十八烷基胺，十八烷基胺作為有機(jī)小分子，其自組裝降低了電荷轉(zhuǎn)移率。自組裝十八烷基胺后，其Rct增加至195KQ。由圖I交流阻抗曲線的變化及電荷轉(zhuǎn)移電阻Rct的變化，說明石墨烯與十八烷基胺之間完成了自組裝。圖4(b)顯示，十八烷基胺固定DNA后，其電荷轉(zhuǎn)移電阻有所增加。這是因?yàn)樵谑送榛飞线M(jìn)行固定的DNA鏈上產(chǎn)生了一定量的負(fù)電荷，負(fù)電荷界面與負(fù)電荷化的DNA產(chǎn)生靜電排斥作用，因此阻礙了電荷的轉(zhuǎn)移，致使Rct增力口。當(dāng)TMM目標(biāo)DNA與探針接觸時，由于堿基對之間不匹配，無法雜交，并未引起Rct的較大變化。而當(dāng)MMO目標(biāo)DNA與探針DNA接觸時，由于堿基對之間相互匹配，能夠完成雜交，導(dǎo)致了 Rct值的明顯變化，從176KQ增加至245KQ。·
權(quán)利要求
1.ー種DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)生物傳感器的硅片基底自組裝上石墨烯薄膜 首先將硅片置于2-5ml的十八烷基三甲氧基硅烷(Ttos)溶液中，避光密封浸泡12-14h ;其次，取出硅片用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?；完成硅片與十八烷基三甲氧基硅烷的自組裝；把自組裝后的硅片放入石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝； 2)生物傳感器的金膜基底自組裝上石墨烯薄膜 首先將金膜置于2-5ml的標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3-5h ;其次，取出金膜用去離子水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，完成金膜與標(biāo)準(zhǔn)I-十八硫醇的自組裝；把自組裝后的金膜放入石墨烯懸浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成石墨烯的自組裝； 3)DNA探針的固定及靶向DNA與DNA探針的雜交 將自組裝過石墨烯的硅片和金膜放入2-5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡5-7h ；取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成十八烷基胺與石墨烯之間的自組裝；將自組裝過十八烷基胺的硅片和金膜依次在Pl溶液、TMM和MMO溶液中分別浸泡24h，取出后用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，完成DNA的固定與雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中十八烷基三甲氧基硅烷溶液為こ醇配制的濃度為0. 01mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干所述的步驟2)中I-十八硫醇溶液的濃度為0. 28mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的石墨烯懸浮液和步驟3)中所述的十八烷基胺溶液的濃度均為0. lmg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液的濃度均為IrtllO].し
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA生物傳感器制備方法，所述DNA生物傳感器中硅片基底和金膜基底由石墨烯自組裝薄膜組成，其中硅片基底為通過十八烷基三甲氧基硅烷自組裝上石墨烯薄膜，而金膜基底為通過1-十八硫醇自組裝上石墨烯薄膜。發(fā)明設(shè)計(jì)并組裝了具有功能性的石墨烯薄膜，并制作了DNA生物傳感器，通過各種電學(xué)測試表明，自組裝前后及DNA固定雜交前后電性能、元素組成及結(jié)構(gòu)有明顯的變化，并能明顯觀察到目標(biāo)DNA濃度的變化對其峰值的影響。這種自組裝制備的生物芯片在DNA生物傳感器及DNA檢測上有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/26GK102788824SQ20121018571
公開日2012年11月21日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者張治紅 申請人:張治紅