專利名稱：一種同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的新型檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測領(lǐng)域，特別涉及一種同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的時間分辨熒光免疫分析方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(Ig)輕鏈分為K (kappa)和入(lambda) 2個型別，每個Ig分子上只有一個型別的輕鏈，人類K (kappa)和\ (lambda)的比例為6 : 4。輕鏈為能自由通過腎小球基底膜的小分子蛋白質(zhì)，在腎小管被重吸收回到血循環(huán)中，所以正常人尿中只有少量輕鏈存在。當(dāng)發(fā)生代謝失調(diào)和多發(fā)性骨髓瘤時，血中會出現(xiàn)大量游離輕鏈，并由尿中排出，即為本周蛋白(Bence-Jones蛋白)。已有顯著的基礎(chǔ)和臨床研究表明，血清游離輕鏈檢測，可用于單克隆丙種球蛋白病初篩，其敏感性為88 % 98 % ;可用于AL淀粉樣變性病早期診斷；可用于常規(guī)電泳方法無法檢測到的不分泌性多發(fā)性骨髓瘤(NSMM)病人檢測，其敏感性達(dá)65% 70%;此外對骨髓瘤病情進(jìn)展具有重要預(yù)后作用，可對未定性單克隆丙種球蛋白病患者進(jìn)行風(fēng)險分層和治療效果的快速評估，還可用于化療或自身外周血干細(xì)胞移植后是否復(fù)發(fā)的監(jiān)測。正常人血清游離輕鏈濃度為3 19mg/L,其中X型游離輕鏈為6 26mg/L, k /入比值為0. 26 I. 65。到目前為止,市場上尚無游離輕鏈的國際參考品,檢測方法也沒有統(tǒng)一，所以，不同廠家試劑盒的檢測結(jié)果也不具可比性。目前市場上常用的檢測方法為免疫比濁法，存在靈敏度和精密度均不夠理想及會因抗原量過大而產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)等缺點。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的新的免疫測定技術(shù)。它是一種在熒光免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特殊熒光分析技術(shù)。熒光分析利用了熒光波長與其激發(fā)光波長的巨大差異，但當(dāng)進(jìn)行超微量分析時，激發(fā)光的雜散光會嚴(yán)重影響對熒光的檢測。解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測量時沒有激發(fā)光的存在。但普通熒光標(biāo)記物的熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長，可達(dá)l/2ms，能夠滿足測量要求，因此而產(chǎn)生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強度的分析方法。TRFIA所用的熒光標(biāo)記物是鑭系元素螯合物，利用這類熒光物質(zhì)熒光壽命長及斯托克斯(Stokes)位移大的特點，通過波長和時間兩種分辨技術(shù)，有效排除了非特異本底熒光的干擾，具有靈敏度高，標(biāo)記物制備簡單，穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬，操作方便等優(yōu)點，成為最有發(fā)展前途的超微量分析技術(shù)和當(dāng)前標(biāo)記免疫分析發(fā)展到新階段的代表。在實際應(yīng)用中，通常還在突光標(biāo)記物中加入一種增強液(Enhancement solution),可增強突光效果上百萬倍。目前,還沒有采用TRFIA檢測游離lambda輕鏈的技術(shù),更缺乏同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的技術(shù)
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的方法中，對游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈分別進(jìn)行檢測，檢測過程復(fù)雜和繁瑣，靈敏度和精密度均不夠理想及會因抗原量過大而產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)等缺點，提供一種同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的方法及其試劑盒，該檢測方法及其試劑盒靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好，操作簡單、迅捷，能極大地提聞診斷效率。
本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗和研究，驚喜的發(fā)現(xiàn)，利用TRFIA可以比較容易地實現(xiàn)免疫雙標(biāo)記分析，同時測定游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈,從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是，一種用于同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的時間分辨熒光免疫分析的試劑盒，包括以下試劑I)同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體，2)用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體，3)用另一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體，4)游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的標(biāo)準(zhǔn)品，5)緩沖液，6)洗滌液，7)增強液。根據(jù)本發(fā)明，試劑I)為同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體。所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體為來自非人源哺乳動物的抗人IgG抗體的多克隆抗體。較佳地，所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體為兔抗人抗體，更佳地為兔抗人IgG H&L多克隆抗體。較佳地，所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體為固相抗體。所述固相抗體的固相載體較佳地選用低熒光本底高吸附反應(yīng)板，優(yōu)選96孔板或48孔板。所述的固相抗體可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的抗體包被固相載體的方法制備，較佳地包括如下步驟采用所述反應(yīng)板作為固相載體，用所述同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體包被反應(yīng)板，再用封閉液封閉，然后真空抽干，即得固相抗體。較佳地，在包被時，所述同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體用緩沖液稀釋至I 10mg/L作為包被液；所述緩沖液是pH為9. 0 9. 8的Na2CO3-NaHCO3緩沖液；所述封閉液為含0. 2 (w/v) %明膠和2 (w/v) %蔗糖的50mmol/L、pH為7. 0 7. 4的Tris-HCl緩沖液。真空抽干后，所得的固相抗體(如反應(yīng)板)較佳地可以在密封后置于_20°C冷凍保存。根據(jù)本發(fā)明，試劑2)為用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體。所述的抗游離kappa輕鏈抗體為來自非人源哺乳動物的單克隆抗體或多克隆抗體；較佳地，所述的抗游離kappa輕鏈抗體為抗游離kappa輕鏈多克隆抗體,其僅與游離形式的kappa輕鏈結(jié)合，與完整抗體及其重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)均不結(jié)合。更佳地，所述的抗游離kappa輕鏈抗體為兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體。所述的抗游離kappa輕鏈抗體可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白標(biāo)記方法制備，較佳地包括如下步驟用r3+-n2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(R3+-DTTA)與抗游離kappa輕鏈抗體反應(yīng),其中R代表銪或衫,反應(yīng)液經(jīng)過柱層析分離純化，即得。其中，所述的抗游離kappa輕鏈抗體與R3+-DTTA的質(zhì)量比較佳地為I : 0. 2 0. 5。根據(jù)本發(fā)明，試劑3)為用另一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體。同樣，所述抗游離lambda輕鏈抗體為來自非人源哺乳動物的單克隆抗體或多克隆抗體；較佳地，所述的抗lambda輕鏈抗體為多克隆抗體,其僅與游離形式的lambda輕鏈結(jié)合,與完整抗體及其重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)不結(jié)合。更佳地，所述的抗游離lambda輕鏈抗體為兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體。所述的抗游離lambda輕鏈抗體可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)記方法制備，較佳地包括如下步驟用R3+-DTTA與抗游離lambda輕鏈多克隆抗體反應(yīng)，其中R代表釤或銪，反應(yīng)液經(jīng)過柱層析分離純化，即得。其中，所述的抗游離lambda輕鏈多克隆抗體與R3+-DTTA的質(zhì)量比較佳地為I : 0.2 0.5。根據(jù)本發(fā)明，試劑2)所述的抗游離kappa輕鏈抗體，具有一種鑭系元素標(biāo)記，試劑3)所述的抗游離lambda輕鏈抗體具有另一種鑭系元素標(biāo)記，所述的鑭系元素較佳地選自銪和釤中的任何一種；在同一試劑盒中，標(biāo)記所述抗游離kappa輕鏈抗體的鑭系元素和所述抗游離lambda輕鏈抗體的鑭系元素不相同。 根據(jù)本發(fā)明，試劑4)為游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的標(biāo)準(zhǔn)品。較佳地，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的混合標(biāo)準(zhǔn)品。更佳地，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為包括0 600mg/L的所述游離kappa輕鏈與相同濃度的所述游離lambda輕鏈的混合標(biāo)準(zhǔn)品。最佳地，所述的混合標(biāo)準(zhǔn)品包括如下濃度的所述游離kappa輕鏈與相同濃度的所述游離 lambda 輕鏈0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。根據(jù)本發(fā)明，試劑5)為緩沖液。較佳地,所述的緩沖液為Tris-HCl緩沖液；更佳地，所述的緩沖液為含8mmol/L NaCl>0. lwt*%明膠、0. 2wt% IgG、50 ii mol/L 二乙烯三胺五乙酸、0. lml/L Tween-80 和 0. Iwt % NaN3 的 50mmol/L> pH7. 2 的 Tris-HCl 緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，試劑6)為洗滌液。較佳地，所述的洗滌液為Tris-HCl緩沖液；更佳地，所述的洗漆液為含 14. Smmol /T, NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt% NaN3 的 SOmmoI /I,、pH7. 2 的 Tris-HCl 緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，試劑7)為增強液。較佳地，所述的增強液為含有￠-二酮的緩沖液；更佳地，所述的增強液為含15y mol/L ￠-萘甲酰三氟丙酮、50 y mol/L三正辛基氧化膦和0. I (v/v) % TritonX-100的pH3. 2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是，一種根據(jù)上述的試劑盒同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的時間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)，依次包括以下步驟I)在包被有同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體的固相載體中，加入游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育；2)用洗滌液洗滌后,加入用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體和用另一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體，進(jìn)行孵育；3)用洗滌液洗滌，然后加入增強液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。本發(fā)明用同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體作為捕獲抗體，使用分別僅針對游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的另外二種抗體作為標(biāo)記抗體，利用雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析檢測原理，建立可同時檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的新型檢測方法。較佳地，本發(fā)明采用兔抗人IgGH&L多克隆抗體為捕獲抗體，采用Sm3+標(biāo)記的抗人游離lambda輕鏈抗體和Eu3+標(biāo)記的抗人游離kappa輕鏈抗體為標(biāo)記抗體,其檢測的原理如圖I所示。根據(jù)本發(fā)明，步驟I)為在包被有同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體的固相載體中，加入游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育。其中，所述固相載體較佳地為低熒光本底高吸附反應(yīng)板，即將所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體包被在反應(yīng)板上；所述孵育的條件同常規(guī)，較佳地為25 37°C，I 2小時。孵育后，所述游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品中的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈與固相的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體形成免疫復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)為用洗滌液洗滌后，加入用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體和用另一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體，進(jìn)行孵育。其中，所述的抗游離kappa輕鏈抗體具有一種鑭系元素標(biāo)記,所述的抗游離lambda輕鏈抗體具有另一種鑭系元素標(biāo)記，所述的鑭系元素較佳地選自銪和釤；在同一次檢測操作中，標(biāo)記所述的抗游離kappa輕鏈抗體的鑭系元素和標(biāo)記所述的抗游離lambda輕鏈抗體的鑭系元素不相同。 因為鑭系元素在受激發(fā)后發(fā)射波長和熒光壽命相對較大，時間分辨熒光免疫分析法可利用這些鑭系元素波長和熒光壽命的不同，將標(biāo)記物區(qū)別開來。從發(fā)射波長看，若選用Eu3+(615nm)與Tb3+(544nm)作雙標(biāo)記配對，區(qū)分較明顯，但是要同時測定它們，就需用氟化脂肪P - 二酮螯合劑，而其對Eu3+的測定效果卻較差，因而，Eu3+與Tb3+作雙標(biāo)記配對時，測定結(jié)果并不好。Eu3+與Sm3+的最大發(fā)射波長雖然只相差約30nm，但因多是窄發(fā)射峰，已能被充分分辨，在340nm激發(fā)光作用下，兩者都能與0-NTA(0-二酮)形成高度發(fā)熒光的螯合物，且它們的熒光壽命相差顯著(Sm3+為50s，Eu3+為730s)，可通過時間延遲充分分辨。因此，優(yōu)選Eu3+和Sm3+作為配對的雙標(biāo)記用于時間分辨熒光免疫分析法。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)中用洗滌液是為了洗滌步驟I)的孵育后的固相載體，所述的固相載體上載有所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體，即捕獲抗體，所述的捕獲抗體與加入的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品中的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈(即抗原)因抗原-抗體的作用而結(jié)合，而游離的未與捕獲抗體反應(yīng)的其他成份，用洗滌液洗滌去除。本發(fā)明中，作為抗原，游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈復(fù)合物中的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈都與固相載體上的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體結(jié)合，但是這些游離輕鏈在其他的抗原表位還可以結(jié)合其他抗游離輕鏈抗體，即步驟2)所述的抗游離kappa輕鏈抗體和抗游離lambda輕鏈抗體。經(jīng)過孵育后，分別形成了夾心復(fù)合物。孵育的方法同常規(guī)，較佳地為25 37°C，I 2小時。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)為用洗滌液洗滌，然后加入增強液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。其中，所述的洗滌液如上所述，用洗滌液洗滌是為了去除游離的抗游離kappa輕鏈抗體和抗游離lambda輕鏈抗體。本發(fā)明中，增強液中的￠-二酮可以倍增熒光信號。加入增強液進(jìn)行振蕩反應(yīng)后，形成高度發(fā)熒光的螯合物。反應(yīng)的溫度和時間，較佳的為25 37°C，5分鐘。在340nm激發(fā)光作用下，所形成的螯合物發(fā)射很強的熒光，Sm3+的熒光壽命為50s，Eu3+的熒光壽命為730s，用時間分辨熒光儀器測定其熒光強度。熒光強度分別與樣品中的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度成正比,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中抗原的量。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用高靈敏的時間分辨熒光免疫分析技術(shù)，建立了同時檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的方法。該方法靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好，特別適用于血清，尿液或其他體液(如心包積液、腹水、尿液等)中游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈含量的檢測。本發(fā)明所用試劑成本低，操作方法簡單，分析系統(tǒng)可實現(xiàn)高度自動化，可提高臨床檢驗的速度，又可大幅度降低人為誤差，增加檢出結(jié)果的可靠性，此外，同時檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈也可極大提高相關(guān)疾病的診斷效率。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖I時間分辨熒光免疫分析同時檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的原理示意圖。圖2為本發(fā)明檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的雙標(biāo)記TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線及精密度圖。A圖游離kappa輕鏈，B圖游離lambda輕鏈。
具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施例中所述的“室溫”，為試驗操作的實驗室溫度，為18 25°C。其中，下列實施例中的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體購自Abcam公司兔抗人 IgG H&L 多克隆抗體(Rabbit anti-Human IgG H&L secondary antibody, ab6715);抗游離kappa輕鏈抗體為兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體(Polyclonal Rabbit Anti-Humankappa Free Light Chains, Code No. /Code/Code-Nr. A0101),購自 dako 公司，抗游離lambda輕鏈抗體為兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體(Polyclonal Rabbit Anti-HumanLambda Free Light Chains, Code No./Code/Code-Nr. A0101)購自 dako 公司；96 孔微孔板(8 X 12)為 Iabsystem 公司產(chǎn)品；Eu3+和 Sm3+標(biāo)記盒為 PerkerElmer 公司產(chǎn)品；SephadexG-50為Amersham產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動TRFIA檢測儀(Auto DELFIA1235)為 Wallac 產(chǎn)品。實施例I試劑盒的制備每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行96個測量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8條X 12孔，可以拆分為單孔)包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗體。(2) 6 X游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品，包括6個濃度0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。(3) I X銪標(biāo)記抗體I凍干品，使用時用0. 5ml蒸餾水溶解。(4) I X釤標(biāo)記抗體2凍干品，使用時用0. 5ml蒸餾水溶解。(5) I X 緩沖液，30ml。(6) I X洗滌液，30ml，使用時以蒸餾水按I : 25稀釋。(7) IX 增強液，15ml。下面是試劑盒中的各材料所含的具體成分及其制備方法。、
I、微孔反應(yīng)板制備用50mmol/L pH 9. 6Na2C03_NaHC03的緩沖液將兔抗人IgG H&L多克隆抗體稀釋至
Iu g/mL作為包被液,96孔微孔板每孔各加入100 u 1,4°C放置過夜,棄去包被液，用洗漆液(14. 5mmol/L NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt% NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl pH7. 2)沖洗四次，加200iil含0. 2wt%明膠和2wt%庶糖的50mmol/L pH7. 2的Tris-HCl緩沖液封閉，4V放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20 V冷凍保存。2、游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品制備將市售游離kappa輕鏈抗體和游離lambda輕鏈抗體純品，用含0. 2wt % BSA,0. Iwt % NaN3的50mmol/L pH7. 8Tris_Hcl緩沖液將上述定值血清配成如下6個濃度 的包含游離kappa輕鏈和相同濃度的游離kappa輕鏈的混合物0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L,200mg/L, 500mg/L,從而構(gòu)成了系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，而后將每種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品以每 瓶Iml分裝凍干，-20°C干燥保存。該各瓶凍干保存的混合標(biāo)準(zhǔn)品，使用時可各用Iml蒸餾水溶解，得到的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的濃度相同，均分別為0mg/L, 5mg/L, 20mg/L,100mg/L,200mg/L,500mg/L。3、Eu3+標(biāo)記的兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體制備參照Eu3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgEu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Eu3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Eu3+濃度。所得的標(biāo)記率(Eu3+mol/IgG mol)是8. 91，蛋白回收率為87%。將收集的溶液稀釋成Eu3+標(biāo)記的兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體濃度為0. 75mmol/L，每瓶0. 5ml分裝，-20°C干燥保存。4、Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體制備參照Sm3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgSm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Sm3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Sm3+濃度。將收集的溶液稀釋成Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體濃度為0. 73mmol/L,每瓶0. 5ml分裝,_20°C干燥保存，即為試劑盒中的Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體凍干品。5、緩沖液8mmol/L NaCl、0. Iwt % 明膠、0. 2wt*% IgG、50 U mol/L 二乙烯三胺五乙酸、0. lml/L Tween-80 和 0. Iwt % NaN3 的 50mmol/L Tris-HClpH7. 2。6、洗漆液14. Smmol /T, NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt % NaN3 的 SOmmoI /I,Tris-HCl pH7. 2。7、增強液1升pH3. 2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15 Umol^-萘甲酰三氟丙酮，50 u mol三正辛基氧化勝和lmlTritonX-100。使用該試劑盒測定之前注意事項如下(I)使用之前將所有試劑取出回升至室溫(18 30°C )
(2)使用之后立即將所有試劑放回2 8°C保存。(3)如果樣品量大建議用多通道移移器，以減少各樣本反應(yīng)時間上的差異。(4)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。(5)取出需用數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2 8°C。實施例2試劑盒的制備試劑盒中的材料除不含包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗體 的96孔板以外，其它的同實施例I。試劑盒中的各材料的制備方法如下(I)Eu3+標(biāo)記的兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體制備參照Eu3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgEu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Eu3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Eu3+濃度。所得的標(biāo)記率(Eu3+mol/IgG mol)是6. 91，蛋白回收率為77%。將收集的溶液稀釋成Eu3+標(biāo)記的兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體濃度為0. 95mmol/L，每瓶0. 5ml分裝，_20°C干燥保存。(2) Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體制備參照Sm3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgSm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Sm3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Sm3+濃度。將收集的溶液稀釋成Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體濃度為0. 88mmol/L,每瓶0. 5ml分裝,_20°C干燥保存，即為試劑盒中的Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體凍干品。(3)試劑盒中的其他材料(游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品，緩沖液，洗滌液，增強液)的制備方法均同實施例I。實施例3試劑盒的制備每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行48個測量，盒中的材料如下(1)1X48孔板(4條X 12孔，可以拆分為單孔)包被有鼠抗人游離kappa輕鏈單克隆抗體。(2) 6 X游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品，包括6個濃度Omg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。(3) I X銪標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0. 5ml蒸餾水溶解。(4) I X釤標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0. 5ml蒸餾水溶解。(5) I X 緩沖液，30ml。(6) I X洗滌液，30ml，使用時以蒸餾水按I : 25稀釋。(7) IX 增強液，15ml。試劑盒中的各材料的制備方法如下
I、微孔反應(yīng)板制備用50mmol/L pH 9. 6Na2C03_NaHC03的緩沖液將兔抗人IgG H&L多克隆抗體稀釋至IOii g/mL作為包被液,48孔微孔板各加入IOOii 1,4°C放置過夜,棄去包被液,沖洗四次，加200 ill含0. 2wt%明膠和2wt%庶糖的50mmol/L pH7. 2的Tris-HCl緩沖液封閉，4°C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20°C冷凍保存。2、試劑盒中的其他材料(游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品,Eu3+標(biāo)記的鼠抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體，Sm3+標(biāo)記兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體,緩沖液，洗滌液，增強液)的制備方法均同實施例I。實施例4采用TRFIA同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的濃度采用實施例I提供的試劑盒進(jìn)行檢測。
一、實施例I的試劑盒中各材料的稀釋6 X游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品,包括6個濃度0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。銪標(biāo)記抗體凍干品，用0. 5ml蒸餾水溶解。釤標(biāo)記抗體凍干品，用0. 5ml蒸餾水溶解。洗滌液，用蒸餾水按I : 25稀釋。待測樣品200例，取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院健康體檢人員，所有入選人員，其血液學(xué)和影像學(xué)檢查均無異常?？崭钩殪o脈血2ml，分離出血清后，用于本發(fā)明檢測。二、檢測取上述制備的包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗體的微孔反應(yīng)板，加50iU游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品至各自的微孔中，加100 U I緩沖液，室溫振蕩反應(yīng)I小時。洗滌后加200 Ul以緩沖液作稀釋劑，I 100稀釋銪標(biāo)記的兔抗人游離kappa輕鏈多克隆抗體和釤標(biāo)記的兔抗人游離lambda輕鏈多克隆抗體，室溫振蕩反應(yīng)I小時。用洗滌液洗滌6次，加增強液200 Ul振蕩5分鐘后用全自動TRFIA檢測儀測量熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算樣品中的游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的含量。表I正常人血清游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的含量
項目_參考值_'
kappa3.3 19.4 mg/L
lambda5.7-26.3 mg/L
kappa/lambda ratio0.26~1.65三、游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈的TRFIA性能指標(biāo)考核I.靈敏度和線性范圍游離kappa輕鏈/游離lambda輕鏈的TRFIA典型標(biāo)準(zhǔn)曲線和各濃度值的變異系數(shù)見圖2。每個濃度點重復(fù)測10次，計算變變系數(shù)。圖2顯示各標(biāo)準(zhǔn)品濃度值的變異系數(shù)均小于10%。
以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測量20次，計算其熒光均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以該點熒光測定值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經(jīng)測定本試驗靈敏度為0. 81mg/L(游離kappa輕鏈)和0. 35mg/L(游離lambda輕鏈)。2.準(zhǔn)確度(回收試驗)將實施例I中的凍干的系列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為游離kappa輕鏈濃度11. 89, 51. 06,110. 33mg/L,加入至5個已知游離kappa輕鏈濃度的血清樣本中(其游離 kappa 輕鏈濃度依次為 28. 65，56. 74，90. 92，154. 56，299. 68mg/L)。游離 lambda輕鏈濃度10. 67,58. 81,226. 03mg/L,加入至5個已知游離lambda輕鏈濃度的血清樣品中(10. 59，23. 13，58. 63，116. 43，27 7. 45mg/L。通過計算實測值與理論值的比值，得出本實驗在可測范圍內(nèi)其回收率。游離kappa輕鏈為95. 32%-101.6% ;游離lambda輕鏈為96. 78% -101. 24%。3.精密度取7份含不同濃度游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的血清樣本，樣本來源和處理同實施例4，按相同的實驗條件，在10天內(nèi)重復(fù)檢測定10次，每次實驗時每份標(biāo)本重復(fù)測10次，計算批內(nèi)批間的變異系數(shù)。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10 %，符合試劑盒規(guī)定要求。
權(quán)利要求
1.一種用于同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的時間分辨熒光免疫分析的試劑盒，其特征在于，包括以下試劑 1)同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體， 2)用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體， 3)用另ー種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體， 4)游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的標(biāo)準(zhǔn)品， 5)緩沖液， 6)洗滌液， 7)增強液。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體是來自非人源哺乳動物的抗人IgG抗體的多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體為固相抗體；所述固相抗體的固相載體為低熒光本底高吸附反應(yīng)板。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，試劑2)所述的用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體是來自非人源哺乳動物的抗人游離kappa輕鏈的單克隆抗體或多克隆抗體；試劑3)所述的用另ー種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體是來自非人源哺乳動物的抗人游離lambda輕鏈的單克隆抗體或多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，試劑4)所述的標(biāo)準(zhǔn)品為游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的混合標(biāo)準(zhǔn)品。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的混合標(biāo)準(zhǔn)品包括O 600mg/L的所述游離kappa輕鏈與相同濃度的所述游離lambda輕鏈。
7.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的鑭系元素選自銪和釤中的任何一種。
8.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，試劑5)所述的緩沖液為Tris-HCl緩沖液；試劑6)所述的洗滌液為Tris-HCl緩沖液；試劑7)所述的增強液含有β - ニ酮。
9.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，試劑5)所述的緩沖液為含8mmol/LNaCl,O. Iwt % 明膠、O. 2wt % IgG、50 μ mol/L ニ こ烯三胺五こ酸、0. lml/L Tween-80 和 O. Iwt %NaN3的50mmol/L、pH7. 2的Tris-HCl緩沖液；試劑6)所述的洗滌液為含14. 5mmol/L NaCl、O. 2ml/L Tween-80 和 O. 2wt% NaN3 的 50mmol/L、ρΗ7· 2 的 Tris-HCl 緩沖液；試劑 7)所述的增強液為含15 μ mol/L β -萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol/L三正辛基氧化膦和O. I (v/v) %TritonX-IOO的pH為3. 2的鄰苯ニ甲酸氫鉀緩沖液。
10.一種根據(jù)如權(quán)利要求I 9任一項所述試劑盒同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的時間分辨熒光免疫分析方法，依次包括以下步驟 1)在包被有同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體的固相載體中，加入游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育； 2)用洗滌液洗滌后,加入用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體和用另ー種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體，進(jìn)行孵育； 3)用洗滌液洗滌，然后加入增強液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括1)同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體，2)用一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離kappa輕鏈抗體，3)用另一種鑭系元素標(biāo)記的抗游離lambda輕鏈抗體，4)游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的標(biāo)準(zhǔn)品，5)緩沖液，6)洗滌液，7)增強液。本發(fā)明用一種同時針對人源抗體重鏈和輕鏈的抗體作為捕獲抗體，使用分別僅針對游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈的另外兩種抗體作為標(biāo)記抗體，利用雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析檢測原理，建立可同時檢測游離kappa輕鏈和游離lambda輕鏈濃度的新型檢測方法。該方法靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)高度自動化。
文檔編號G01N33/68GK102735845SQ201210192629
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者王金鳳, 盛世樂 申請人:上海滬晶生物科技有限公司, 上海禾研生物技術(shù)有限公司