專利名稱：利用電化學(xué)核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素ａ的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及食品中赭曲霉毒素A的檢測方法。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素A廣泛存在自然界中，其毒性強(qiáng)，對人類和動植物損害極大。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農(nóng)作物上的曲霉和青霉等產(chǎn)生。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現(xiàn)在豬和母雞等的肌肉組織中。赭曲霉毒素A主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。在動物試驗中觀察到它的致畸作用。
赭曲霉毒素A毒性很強(qiáng)，并且廣泛存在于各種食物、谷物及其副產(chǎn)品中。為了保障人類的健康，非常有必要開展食品中赭曲霉毒素A的檢測研究。赭曲霉毒素A的含量通常很低，所以對檢測手段的要求較高，檢測OTA的定性方法有微柱法，定量分析方法有薄層色譜法、高效薄層色譜法、HPLC、酶聯(lián)免疫吸附法和熒光比色法等。薄層層析法的優(yōu)點是方法簡單，使用的試劑價格便宜，但是存在靈敏度較差，所需試劑繁多，檢測周期長，重現(xiàn)性不好和無法實現(xiàn)自動化等缺點，已不能滿足現(xiàn)代檢測的要求。色譜法可以定性、定量，但是儀器昂貴，操作復(fù)雜且不適合用于大批量樣品的檢測，而且不能用于現(xiàn)場的快速檢測?，F(xiàn)場快速篩選方法以酶聯(lián)免疫吸附法較多。但這種方法是基于抗原-抗體的親和反應(yīng)，以抗體作為識別分子。由于抗體容易受到外界環(huán)境尤其是溫度的影響，限制了方法的靈活應(yīng)用。此外，抗體制備也需經(jīng)過動物實驗或者細(xì)胞實驗，繁瑣費時，制備成本高，檢測的成本也高。所以有必要發(fā)展一種快速方便，檢測成本低，檢測靈敏度高的新型檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有赭曲霉毒素A檢測成本高、檢測方案復(fù)雜、檢測時間過長的缺點，本發(fā)明提供一種利用電化學(xué)核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A的方法。具體的技術(shù)解決方案如下在有赭曲霉毒素A存在的情況下，本發(fā)明中所述適配體與赭曲霉毒素A特異性結(jié)合，引起核酸適配體的空間結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步影響核酸適配體上修飾的電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)與電極表面電子傳遞的速率，從而影響電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)的氧化還原峰電流值，通過電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)顯示的氧化還原峰電流值與赭曲霉毒素A濃度之間的線性變化關(guān)系，建立赭曲霉毒素A的一步快速電化學(xué)傳感器檢測新方法。本發(fā)明利用電化學(xué)核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A方法的具體操作步驟如下
(I).裸金電極表面的拋光處理
將裸金電極在濃度0. 3 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5min，再在濃度0.05 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗5 min，最后在去離子水中超聲清洗5 min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化招粉末；
(2).適配體電化學(xué)傳感器的修飾
取ImL濃度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取6 mL濃度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在步驟(I)拋光處理后的裸金電極表面，溫度30°C條件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極2 3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200mL濃度2mmol/L的6-巰基己醇中，并在溫度30°C條件下封閉4h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)核酸適配體傳感器；
赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，所述單鏈DNA探針的序列從5’端到3’端為 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述單鏈 DNA 探針的 3’ 末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)；
濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍(lán)的DNA適配體探針溶液；
(3).對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
將電化學(xué)核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，置于10 mL濃度100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的PH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入濃度為lmg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液,置入所述工作電極,室溫孵育反應(yīng)5 IOmin ；掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0.001 V，振幅為0. 05 V,得到含有赭曲霉毒素A濃度為0. 01pg/mL的氧化還原峰圖譜及其氧化還原峰電流；
同理，在含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液中接著加入濃度為lmg/L赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液分別得到含有赭曲霉毒素A的終濃度為0. lpg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的終濃度為I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的終濃度為10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的終濃度為100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D為四種標(biāo)準(zhǔn)液；將工作電極分別依次置入四種標(biāo)準(zhǔn)液中，分別反應(yīng)5 IOmin ;分別掃描四種標(biāo)準(zhǔn)液的方波伏安圖譜并記錄相應(yīng)的氧化還原峰電流值；以含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液和四種標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值作為縱坐標(biāo)，以含有0. 01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的濃度和四種標(biāo)準(zhǔn)赭曲霉毒素A溶液的濃度作為橫坐標(biāo),建立赭曲霉毒素一步法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4).對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進(jìn)行定量檢測
將作為工作電極的電化學(xué)核酸適配體傳感器浸沒在10 mL濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入含有未知濃度的赭曲霉毒素A溶液,反應(yīng)5 10 min,掃描方波伏安圖譜,掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0. 001V，振幅0. 05 V ;得到特定濃度赭曲霉毒素對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值，通過所述赭曲霉毒素一步法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出所述未知濃度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的濃度。檢測赭曲霉毒素A所用的生物傳感器,是對目標(biāo)赭曲霉毒素A敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行檢測的儀器。是由固定化的生物敏感材料作識別探針(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等等)及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)計劃技術(shù)篩選而來的。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點。電化學(xué)核酸適配體傳感器在快速檢驗中發(fā)揮著重要作用，它將電化學(xué)信號傳導(dǎo)的高靈敏性和核酸適配體的高親和性相結(jié)合。電化學(xué)核酸適配體傳感器制備簡便、易修飾、靈敏高、測試費用低、適于聯(lián)機(jī)化、穩(wěn)定性好和結(jié)合目標(biāo)物范圍廣等優(yōu)點。本發(fā)明解決了赭曲霉毒素A檢測成本高，檢測方案復(fù)雜，檢測時間過長的缺點。本發(fā)明采用可特異性識赭曲霉毒素A的核酸適配體應(yīng)用于電化學(xué)傳感器，大大的提高了檢測的靈敏性，降低了檢測成本，并且檢測快速，只需一步，不需要復(fù)雜的檢測手段和昂貴的儀器，是一種快速方便，檢測成本低，檢測靈敏度高的新型一步現(xiàn)場檢測方法。
綜上所述本發(fā)明的有益效果具體體現(xiàn)在以下方面
1.本發(fā)明采用能與赭曲霉毒素A特異性結(jié)合的核酸適配體探針作為識別探針，構(gòu)建相關(guān)的傳感界面作為生物傳感器用于檢測，提高了檢測赭曲霉毒素的靈敏性，最低可以檢測出0. 01 pg/mL的赭曲霉毒素A ;
2.本發(fā)明作為基于核酸適配體的電化學(xué)檢測赭曲霉毒素A的一種方法，大大降低了檢測目標(biāo)毒素的成本，操作簡單方便；
3.本發(fā)明一步快速檢測赭曲霉毒素A，電化學(xué)核酸適配體傳感器制備完成后，僅需5 10 min就可以實現(xiàn)一步檢測出赭曲霉毒素A。


圖I為赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。實施例
(1)裸金電極表面的拋光處理
將裸金電極在濃度0. 3 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，再在濃度0.05 mol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗5 min，最后在去離子水中超聲清洗5 min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化招粉末；
(2)適配體電化學(xué)傳感器的修飾
取2 mL濃度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到198 mL濃度為I mmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取12 mL濃度I mmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在(I)中拋光處理后的裸金電極表面，溫度30°C條件下孵育2 h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗核酸適配體修飾的電極2 3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200 mL濃度2 mmol/L的6-巰基己醇中，并在溫度30 °C條件下封閉4 h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)核酸適配體傳感器；
與赭曲霉毒素A特異性結(jié)合的核酸適配體為單鏈DNA探針，該單鏈DNA的序列從5’端到 3’端為 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，該單鏈 DNA 的 3’末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)；
所述與赭曲霉毒素A特異性結(jié)合的核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍(lán)的DNA適配體探針溶液；
(3)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將電化學(xué)核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，置于10 mL濃度100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的PH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入濃度為I mg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到含有赭曲霉毒素A濃度為0. 01 pg/mL的溶液，將工作電極置入后，室溫孵育反應(yīng)5 IOmin ;掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0.001 V，振幅為0.05 V，得到含有赭曲霉毒素A濃度為0.01pg/mL的氧化還原峰圖譜及其氧化還原峰電流；
同理，在含有赭曲霉毒素A濃度0.01 pg/mL的溶液中接著加入濃度為I mg/L赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液分別得到含有赭曲霉毒素A的終濃度為0. I pg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的終濃度為I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的終濃度為10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的終濃度為100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D為四種標(biāo)準(zhǔn)液；將工作電極分別依次置入四種標(biāo)準(zhǔn)液中，分別反應(yīng)5 IOmin ;分別掃描四種標(biāo)準(zhǔn)液的方波伏安圖譜并記錄相應(yīng)的氧化還原峰電流值；以五種赭曲霉毒素A濃度對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值作為縱坐標(biāo)，以赭曲霉毒素A的濃度作為橫坐標(biāo),建立赭曲霉毒素一步法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4)對含赭曲霉毒素A的紅酒樣品溶液進(jìn)行定量檢測
將作為工作電極的電化學(xué)核酸適配體傳感器浸沒在10 mL濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入I mL含有未知濃度的赭曲霉毒素A紅酒溶液,反應(yīng)5 10 min,掃描方波伏安圖譜,掃描高電位為0V,低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0.001V，振幅0.05 V ;得到含有特定濃度赭曲霉毒素A紅酒樣品對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值，通過所述赭曲霉毒素A —步法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出紅酒樣品中赭曲霉毒素A的濃度。
權(quán)利要求
1.利用電化學(xué)核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所述方法的具體操作步驟如下 (1).裸金電極表面的拋光處理 將裸金電極在濃度0. 3 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5min，再在濃度.0.05 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗.5 min，最后在去離子水中超聲清洗5 min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化招粉末； (2).適配體電化學(xué)傳感器的修飾 取ImL濃度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取6 mL濃度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在步驟(I)拋光處理后的裸金電極表面，溫度30°C條件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極2 3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200mL濃度2mmol/L的6-巰基己醇中，并在溫度30°C條件下封閉4h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)核酸適配體傳感器； 赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，所述單鏈DNA探針的序列從5’端到3’端為 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述單鏈 DNA 探針的 3’ 末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)； 濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍(lán)的DNA適配體探針溶液； (3).對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將電化學(xué)核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，置于10 mL濃度100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的PH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入濃度為lmg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液,置入所述工作電極,室溫孵育反應(yīng)5 IOmin ；掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0.001 V，振幅為0. 05 V,得到含有赭曲霉毒素A濃度為0. 01pg/mL的氧化還原峰圖譜及其氧化還原峰電流； 同理，在含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液中接著加入濃度為lmg/L赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液分別得到含有赭曲霉毒素A的終濃度為0. lpg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的終濃度為I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的終濃度為10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的終濃度為100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D為四種標(biāo)準(zhǔn)液；將工作電極分別依次置入四種標(biāo)準(zhǔn)液中，分別反應(yīng)5 IOmin ;分別掃描四種標(biāo)準(zhǔn)液的方波伏安圖譜并記錄相應(yīng)的氧化還原峰電流值；以含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液和四種標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值作為縱坐標(biāo)，以含有0. 01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的濃度和四種標(biāo)準(zhǔn)赭曲霉毒素A溶液的濃度作為橫坐標(biāo),建立赭曲霉毒素一步法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4).對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進(jìn)行定量檢測將作為工作電極的電化學(xué)核酸適配體傳感器浸沒在10 mL濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入含有未知濃度的赭曲霉毒素A溶液,反應(yīng)5 10 min,掃描方波伏安圖譜,掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0. 001V，振幅0. 05 V ;得到特定濃度赭曲霉毒素對應(yīng)的氧化還原峰峰電流值，通 過所述赭曲霉毒素一步法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出所述未知濃度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用電化學(xué)核酸適配體傳感器快速一步檢測赭曲霉毒素Ａ的方法。所述方法的具體操作步驟如下(1)裸金電極表面的拋光處理，(2)適配體電化學(xué)傳感器的修飾；(3)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明提高了檢測赭曲霉毒素的靈敏性，最低可以檢測出0.01pg/mL的赭曲霉毒素A；大大降低了檢測目標(biāo)毒素的成本，操作簡單方便；僅需5～10min就可以實現(xiàn)一步檢測出赭曲霉毒素A。
文檔編號G01N27/48GK102735740SQ20121019431
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者吳晶晶, 張睿, 梅占龍, 蔣原, 薛峰, 陳偉, 陳寒清 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)