專利名稱：納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種內(nèi)毒素檢測(cè)方法，尤其涉及一種納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，屬于細(xì) 菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)菌內(nèi)毒素為脂多糖，也被稱為脂質(zhì)體，其是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的成分，廣泛存在于自然界中，該物質(zhì)進(jìn)入人體血液會(huì)引起發(fā)熱，俗稱熱原反應(yīng)。由于此類物質(zhì)可能致人產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此在藥物注射劑中需要嚴(yán)格控制。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)可以分為定性檢測(cè)和定量檢測(cè)兩類。常規(guī)的檢測(cè)方法為家兔法，將供試品靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察體溫的變化情況。該方法干擾因素多，靈敏度差，特別是對(duì)退熱作用的藥物或清熱解毒類的注射劑可能還會(huì)出現(xiàn)假陰性。藥典中的內(nèi)毒素檢測(cè)均采用鱟試劑法，其中鱟試劑凝膠法是在適宜的條件下(溫度、PH值及無干擾物質(zhì))，細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠；鱟試劑濁度法是依據(jù)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化與內(nèi)毒素濃度呈線性關(guān)系，從而測(cè)定內(nèi)毒素含量。這些方法準(zhǔn)備期長(zhǎng)，檢測(cè)耗時(shí)，成本高，不能實(shí)現(xiàn)快速、連續(xù)、在線檢測(cè)。另有些方法的探索性研究較多，還未能形成應(yīng)用，或者不能克服需添加試劑或使用昂貴儀器等缺點(diǎn)，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的直接檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，而提出一種納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，以降低成本并提高檢測(cè)速度。該方法包括如下步驟步驟I :制備系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用納米粒徑分析儀對(duì)這些內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行粒徑檢測(cè)；步驟2 :對(duì)檢測(cè)所得的粒徑數(shù)據(jù)與相應(yīng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線ln(d)=k · C+b,式中d為粒徑，C為內(nèi)毒素濃度，k為校正系數(shù)，b為修正系數(shù)；步驟3 :根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量。所述步驟I中的系列濃度包括至少三個(gè)稀釋濃度；所述步驟2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線評(píng)價(jià)系數(shù)大于O. 98。技術(shù)效果I、每個(gè)樣品的檢測(cè)周期在2 5分鐘，大大縮短了內(nèi)毒素檢測(cè)的時(shí)間，檢測(cè)速度快。2、無需消耗檢測(cè)試劑(鱟試劑)，可大幅降低內(nèi)毒素的檢測(cè)成本。3、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，可靠性高，適用于注射用水、注射劑半成品及成品中的內(nèi)毒素含量測(cè)定。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。由于內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)一端是疏水的脂鏈，一端是親水的糖鏈，類似表面活性劑的疏水端和親水端。細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中以團(tuán)聚的形式存在，團(tuán)聚分子量在幾千到百萬的范圍內(nèi)，根據(jù)溶液的納米膠粒子的特征，其粒徑大小隨濃度的增加而増大。納米粒徑分析儀是常用的檢測(cè)粒徑的儀器，而細(xì)菌內(nèi)毒素分子團(tuán)的粒徑可以被粒徑分析儀所檢測(cè)是我們偶然發(fā)現(xiàn)的。本發(fā)明方法具體包括如下步驟步驟I :采用參考標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，確定所需的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列濃度，該系列濃度包括至少三個(gè)稀釋濃度，制備系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用納米粒徑分析儀對(duì)這些內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行粒徑檢測(cè)。步驟2 :對(duì)檢測(cè)所得的粒徑數(shù)據(jù)與相應(yīng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線ln(d)=k*C+b，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線評(píng)價(jià)系數(shù)需大于O. 98，式中d為粒徑(単位nm), C為內(nèi)毒素濃度(單位EU/ml), k為校正系數(shù)，b為修正系數(shù)。步驟3 :在相同條件下檢測(cè)待測(cè)樣品溶液中的內(nèi)毒素粒徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量。下面提供本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例I、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立設(shè)備材料a、馬爾文Nano ZS ZEW3600型激光粒徑分析儀；b、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)150601-201070，規(guī)格140EU · Amp—1，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；c、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號(hào)100130，湛江博康海洋生物有限公司)。方法步驟取工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，使用檢查用水配制成濃度為100EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再使用檢查用水逐步稀釋成系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，系列濃度分別為50EU/ml、10EU/ml、lEU/ml、0. 25EU/ml。打開粒徑分析儀電源，預(yù)熱30min以上，將系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液按低濃度到高濃度依次加入到檢測(cè)池中進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所測(cè)得的粒徑分布圖中的峰強(qiáng)、峰面積和粒徑分布范圍進(jìn)行數(shù)據(jù)模型運(yùn)算，得到內(nèi)毒素粒徑的對(duì)數(shù)In(d)。以ln(d)作為縱坐標(biāo)Y，以內(nèi)毒素濃度作為橫坐標(biāo)X進(jìn)行回歸分析，線性方程為ln(d)=0. 061C+0. 846，R2 = O. 996，曲線評(píng)價(jià)系數(shù)大于O. 98,標(biāo)準(zhǔn)曲線成立,標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表I所示。 表I
權(quán)利要求
1.一種納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，其特征在于 該方法包括如下步驟 步驟I :制備系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用納米粒徑分析儀對(duì)這些內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行粒徑檢測(cè)； 步驟2 :對(duì)檢測(cè)所得的粒徑數(shù)據(jù)與相應(yīng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線ln(d)=k · C+b,式中d為粒徑，C為內(nèi)毒素濃度，k為校正系數(shù)，b為修正系數(shù)； 步驟3 :根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，其特征在于所述步驟I中的系列濃度包括至少三個(gè)稀釋濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，其特征在于所述步驟2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線評(píng)價(jià)系數(shù)大于O. 98。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米粒徑分析儀用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法，屬于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域。該方法依據(jù)內(nèi)毒素在水溶液中可團(tuán)聚成納米膠粒的特征，先制備至少三個(gè)稀釋濃度的系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用納米粒徑分析儀對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行粒徑檢測(cè)，然后對(duì)檢測(cè)所得的粒徑數(shù)據(jù)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作回歸分析，建立出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線以及待測(cè)樣品中的內(nèi)毒素粒徑計(jì)算出樣品的內(nèi)毒素含量。本發(fā)明檢測(cè)速度快，不消耗檢測(cè)試劑，檢測(cè)成本低，可靠性高。
文檔編號(hào)G01N33/483GK102692494SQ20121019665
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者彭國(guó)平, 李紅陽, 鄭云楓 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)