專利名稱：神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物類免疫檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用，更具體地說，是涉及一種基于磁微粒分離化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的試劑盒及其制備方法，以及應(yīng)用該試劑盒定量檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中。NSE在腦組織細(xì)胞的活性最高，夕卜周神經(jīng)和神經(jīng)分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經(jīng)組織、血清和脊髓液。含NSE的細(xì)胞破壞后會(huì)使NSE釋放入血清，因此可以檢測(cè)出來，正常人血清NSE水平為5 15ng/ml。細(xì)胞免疫化學(xué)的研究結(jié)果揭示，NSE高特異性的定位于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，如APUD細(xì)胞系。通過監(jiān)測(cè)因基因表達(dá)活性改變和細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換所致代謝異常的疾病患者的生物體液，如血清和脊髓中的NSE活性水平，可對(duì)疾病提供診斷的有用信息。1982年Carney等人首先報(bào)道,小細(xì)胞肺癌的大多數(shù)患者顯示血清NSE活性明顯增高。其后，許多研究者也相繼證明，NSE用于小細(xì)胞肺癌診斷，是一個(gè)具有高特異性和高靈敏性的腫瘤標(biāo)記物，其特異性高達(dá)80% 90%，診斷靈敏度達(dá)80%。雖然NSE的異常表達(dá)并不真正構(gòu)成是小細(xì)胞肺癌的早期診斷指標(biāo)。但是，最重要和最有意義的是，NSE活性水平改變同小細(xì)胞肺癌的臨床過程具有很好的相關(guān)性。相關(guān)臨床資料分析結(jié)果顯示，絕大多數(shù)患者經(jīng)化療或合并放療后，腫瘤縮小，NSE明顯降低，與治療前相比具有顯著性差異。相反，若NSE在治療過程中不降低，臨床上腫瘤也不見治療反應(yīng)。紀(jì)樹國(guó)等人指出，經(jīng)化療和放療后，病情穩(wěn)定的絕大多數(shù)病例NSE活性在正常值范圍內(nèi)波動(dòng)。NSE活性不見降低的病例，表明病情控制不理想。NSE在神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷中也得到應(yīng)用，神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童中常見的實(shí)體瘤，它起源于神經(jīng)脊，通常對(duì)它較難做出確切診斷。因?yàn)橹T如橫紋肌肉瘤、Wilms腫瘤等同神經(jīng)母細(xì)胞瘤一樣，有時(shí)也是由未分化的小燕麥細(xì)胞組成。近年來，研究者們應(yīng)用NSE做出鑒別診斷，當(dāng)患神經(jīng)母細(xì)胞瘤時(shí)，NSE陽(yáng)性率可達(dá)96% 100%，其測(cè)定值明顯增高。類似的研究證明，NSE活性水平分析，同樣可以用來監(jiān)測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病情改變，評(píng)價(jià)治療效果和預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)。即在治療后，病情緩解時(shí)NSE活性降低，而復(fù)發(fā)時(shí)，NSE活性復(fù)又升高。這里有一點(diǎn)特別引人興趣，Zeltzer等人發(fā)現(xiàn),如果患者血清NSE的初始水平低于100ng/ml,其預(yù)后良好，存活率高。反之，如果NSE初始水平高于上述數(shù)值，其預(yù)后狀況不佳，存活率明顯為低。因此，臨床中十分注意分析患者血清NSE的初始水平，對(duì)于實(shí)施分類救治方案是有重要意義的。在其他惡性腫瘤中，應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)方法證明，NSE在非小細(xì)胞肺癌的各類型肺癌及其他一些內(nèi)分泌腫瘤亦會(huì)顯示出不同的免疫原性反應(yīng)，為此，Tapia等人認(rèn)為NSE活性幾乎可以在所有的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中檢出。Nakajima認(rèn)為是腫瘤發(fā)生后酶學(xué)表達(dá)的變化，但可以歸結(jié)為某些神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的細(xì)胞是來源于內(nèi)胚層細(xì)胞，顯示出雙相或多相分化所致?？傊?，NSE在小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等內(nèi)分泌腫瘤中顯示出很高的免疫活性，并可在血清中直接檢出，可以用來監(jiān)測(cè)小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的病情發(fā)展，評(píng)價(jià)治療效果，預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)，其方法要比X線胸透檢查來得早和方便，因此，NSE在臨床中已被做為一個(gè)十分有用的血清學(xué)的腫瘤標(biāo)記物予以應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)檢測(cè)臨床上主要以國(guó)外進(jìn)口試劑和免疫組化試劑應(yīng)用為主，國(guó)外進(jìn)口試劑價(jià)格非常昂貴，給患者帶來很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不利于在基層普及。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒目前還較少，也僅停留在96孔微孔板式技術(shù)水平上。該技術(shù)靈敏度較低、線性窄、特異性較差，也不利于高通量的全自動(dòng)檢測(cè)。另外，由于板式檢測(cè)試劑的特性，相對(duì)效期較短，加上神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗原容易失活，實(shí)際使用上，可靠性較低。因此，有待開發(fā)對(duì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測(cè)靈敏度高與可靠性并能降低檢測(cè)成本的檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶所存在的問題，提供一種新的可定量檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的試劑盒，提高檢測(cè)靈敏度及可靠性，并降低成本，延長(zhǎng)有效期。本發(fā)明的另一目的在于提供制備神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述的試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法。一方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括以下試劑組分
校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及化學(xué)發(fā)光底物；其中所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到校準(zhǔn)品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優(yōu)選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇(2-ME)、二巰基乙醇(DTT)、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5% ；所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的將鏈霉親和素和磁微粒偶聯(lián)制得鏈霉親和素磁微粒，利用長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體制得生物素化抗體，然后將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定，制得磁分離試劑；所述酶反應(yīng)物包括堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體；所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物，該多組分免疫復(fù)合物是按照以下方法制備得到的新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : 1.5 2.5 0.4 O. 6的體積比混合，加入硫酸銨沉淀過夜,離心’去上清,將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，70 75°C放置O. 5 2小時(shí)，干燥，制得抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物；所述化學(xué)發(fā)光底物為經(jīng)緩沖液稀釋的APS-5化學(xué)發(fā)光底物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒還可進(jìn)一步包括質(zhì)控品，質(zhì)控品的配制同標(biāo)準(zhǔn)品。具體地，該質(zhì)控品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到質(zhì)控品；其中， 所述還 原劑為含有二硫鍵的化合物，優(yōu)選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)瞵鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、TritonX 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01 % O. 5%。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒中，所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的(如包含質(zhì)控品，質(zhì)控品的具體配制也可按照該方法進(jìn)行)將神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫蘇糖醇的PBS pH7. 2緩沖液中至O. 5mg/ml, 15分鐘后,加入終濃度為ImM賴氨酸反應(yīng)5 120分鐘；將上述反應(yīng)物，按不同濃度用含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液稀釋成不同濃度點(diǎn)，并定標(biāo)，得到校準(zhǔn)品；所述含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液組分為磷酸二氫鈉 50mM，氯化鈉 75mM，Tween 20 O. 02%,Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I%，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白3%，Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉pH 6.8。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒中，所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的磁性微粒與鏈霉親和素的偶聯(lián)取磁微粒，加入MES緩沖液中，加入su lfo-NHS,EDC,反應(yīng)，之后去上清，洗滌，再加入鏈霉親和素反應(yīng)過夜，制得鏈霉親和素磁微粒；更具體的操作可以是取250μ1 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；去上清后加入 20mM MES ρΗ6· O 緩沖液 400 μ 1，80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ 1，25mg/ml EDC5 100 μ 1，反應(yīng)30分鐘；去上清，用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；加入2mg/ml鏈霉親和素150 1000 μ I反應(yīng)過夜；長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體將神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體透析至PBS ρΗ7. 2緩沖液中，濃縮至2 10mg/ml，得抗體溶液；將Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩爾比I : 5 I : 100的比例在抗體溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反應(yīng)過夜；次日，透析至PBS pH7. 2緩沖液中，得生物素化抗體；生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定將鏈霉親和素磁微粒用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至0. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至0. 5 20 μ g/ml的生物素化抗體I毫升，反應(yīng)4小時(shí)；加入含0. 03% TritonXlOOU %蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2緩沖液5毫升；濃縮并真空干燥；再用含0. 15%酪蛋白、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 2% Tween20、0. 02% Proclin300的PBS ρΗ7· 2緩沖液復(fù)溶；制得磁分離試劑。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒中，所述酶反應(yīng)物是按照以下方法配制得到的堿性磷酸酶標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體將堿性磷酸酶透析至PBSpH7. 2緩沖液中；將神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體透析至PBS pH6. 8緩沖液中；在堿性磷酸酶溶液中加入預(yù)先用二甲基亞砜溶解的SMCC溶液，反應(yīng)5分鐘后透析至PBS pH7. 2緩沖液，得活化的堿性磷酸酶溶液；在示蹤抗體溶液中加入預(yù)先用的用PBS pH6. 8緩沖液溶解的2-IT溶液,反應(yīng)15分鐘后,透析至PBS pH7. 2緩沖液,得活化的示蹤抗體溶液；將活化的堿性磷酸酶溶液和活化的示蹤抗體溶液混合，反應(yīng)過夜，得堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體；將上述堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體稀釋至如下組分的緩沖液中磷酸二氫鈉50mM、氯化鈉75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖I %、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋白O. 5%、Proclin 300 O. 02%、氫氧化鈉pH 6. 8，制得所述酶反應(yīng)物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒·中，所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑是按照以下方法配制得到的制備抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物將新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : 2 : O. 5的體積比混合；加入終濃度為57%的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；次日將處理后的混合血清離心，去上清，將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，放置于溫箱中，72°C放置I小時(shí)；用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至50mg/ml，分裝后冷凍干燥；按如下配方配制穩(wěn)定增強(qiáng)劑磷酸二氫鈉50禮，氯化鈉75禮，三乙醇胺2%，多組分免疫復(fù)合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉 pH 6.8。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒中，所述化學(xué)發(fā)光底物是按照以下方法配制得到的按I : 4 10的比例將APS-5化學(xué)發(fā)光底物稀釋至下列組分的緩沖液中三乙醇胺2 %，二乙醇胺0.75%，CTAB2 %，N，N- 二甲二叮呢硝酸鹽0.3%，牛血清白蛋白O. 15 %，BronidoxO. 5%,鹽酸 ρΗ9· 5。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，還進(jìn)一步包括清洗液。該清洗液主要是用于在檢測(cè)過程中清洗與磁分離試劑反應(yīng)后的樣品，清洗液的具體組分可以參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween 20、Proclin300的混合溶液,在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在,檢測(cè)時(shí)適當(dāng)稀釋后使用。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包括步驟分別配制校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、以及化學(xué)發(fā)光底物；各試劑組分的配制參見前面的記載，此處不再贅述；將校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、化學(xué)發(fā)光底物等各試劑組分獨(dú)立地置于包裝容器內(nèi)，得到神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒。另一方面，本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒定量檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法，該方法包括步驟
-分別加30μ I神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本至對(duì)應(yīng)試管底部；-加45μ I酶反應(yīng)物至每一試管中；-加45μ I穩(wěn)定增強(qiáng)劑至每一試管中；-加30μ I磁分離試劑至每一試管中；-用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴15分鐘；-試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
-加清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻；-加200μ I化學(xué)發(fā)光底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的關(guān)鍵包括首先，采用還原劑處理神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗原增加其體外穩(wěn)定性，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖組分中，增加其分散性，防止自身凝集，保持活性，效期至一年以上；其次，將鏈霉親和素和磁微粒偶聯(lián)，并長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記捕獲抗體，通過長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記抗體和偶聯(lián)鏈霉親和素的磁微粒的免疫結(jié)合，延長(zhǎng)抗體在磁微粒上的臂展和正確定向，大大提高了免疫固相的應(yīng)用性能，整體上提高了試劑盒的靈敏度；并且采用了優(yōu)化的固定化方法，使磁分離組分穩(wěn)定性良好，效期可至一年以上；進(jìn)一步，本發(fā)明采用不同種屬血清球蛋白和少量白蛋白的提取，以及對(duì)提取組分和牛血清白蛋白之間相互熱聚合，制備多組分免疫復(fù)合物，通過含免疫復(fù)合物的特別組分體系可解決腫瘤標(biāo)志物夾心法檢測(cè)中異嗜性抗體干擾的問題，提高了終產(chǎn)品的特異性；更進(jìn)一步，本發(fā)明優(yōu)選采用異官能團(tuán)的兩步活化方法，分別活化抗體和堿性磷酸酶的氨基位點(diǎn)，再通過硫基的結(jié)合將活化的堿性磷酸酶和活化的抗體結(jié)合，結(jié)合效率優(yōu)異，自身交聯(lián)極低，提高了最終試劑盒的靈敏度和特異性性能；此外，在化學(xué)發(fā)光底物方面，本發(fā)明采用了靈敏度高和平臺(tái)穩(wěn)定期長(zhǎng)的APS-5底物，并進(jìn)一步優(yōu)化了化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)體系，保證了終產(chǎn)品的信號(hào)靈敏度高和穩(wěn)定性好、變異小。本發(fā)明的試劑盒中未詳細(xì)提及的試劑組分(例如清洗液、一些必要的緩沖液等)、試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨(dú)立包裝容器等均可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，符合相關(guān)行業(yè)規(guī)定即可。本發(fā)明的方法中未詳細(xì)提及的操作步驟也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，例如，在檢測(cè)前，可將各試劑放至室溫(18 25V )，加樣前充分混勻；所用檢測(cè)儀器設(shè)備例如化學(xué)發(fā)光類測(cè)定儀的使用按照說明書操作進(jìn)行。本發(fā)明中，未特別注明單位的比例與含量，固體組分為質(zhì)量比例與含量，液體組分為體積比例與含量。本發(fā)明的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，具有以下有益效果利用本發(fā)明的試劑盒定量檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶，樣本和試劑一次加入，SP方便手動(dòng)操作也利于提高全自動(dòng)操作效率的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定；各試劑組分包括標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、磁分離試劑、化學(xué)發(fā)光底物等穩(wěn)定性良好，效期可至一年以上；檢測(cè)靈敏度高，特異性能好、變異小。在本發(fā)明中，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)的工藝優(yōu)化，得到完善統(tǒng)一工藝，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)操作規(guī)程和質(zhì)量控制規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)。用戶僅需按照操作說明進(jìn)行規(guī)范操作，就可得到可靠的結(jié)果。目前該試劑盒已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局診斷試劑三類注冊(cè)證，在臨床研究中與國(guó)外進(jìn)口試劑的符合相關(guān)性高達(dá)95%以上，且費(fèi)用僅為其1/3。


圖I是神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2是神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒正常值分布的直方圖。圖3是神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒與進(jìn)口試劑的性能對(duì)比?！?br> 具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所用各試劑材料均可商購(gòu)獲得，所用各儀器設(shè)備也是所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有儀器設(shè)備，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。實(shí)施例I本發(fā)明中，所述的捕獲抗體為能與人體內(nèi)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗原特異結(jié)合的單克隆抗體，所述的示蹤抗體為能與神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原特異結(jié)合的單克隆抗體。捕獲抗體和示蹤抗體除能與神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗原特異性結(jié)合外，配對(duì)使用時(shí)可與抗原形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。I、本實(shí)施例所用的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗原采購(gòu)自天健生物制藥(天津)有限公司，本實(shí)施例所用的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)捕獲抗體和示蹤抗體采購(gòu)自天健生物制藥(天津)有限公司。本實(shí)施例中所述的各種緩沖液的配方如下PBS ρΗ7· 2緩沖液
試劑廠商終濃度 IOOOml試劑用量~
憐酸二氧納 Sigma5OmM 6. Og
氯化納Sigma75mM 4. 39g
4M 氫氧化納 SigmaPH 7.2 25mlPBS ρΗ6· 8緩沖液
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括以下試劑組分 校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及化學(xué)發(fā)光底物； 其中 所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到校準(zhǔn)品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優(yōu)選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5% ； 所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的將鏈霉親和素和磁微粒偶聯(lián)制得鏈霉親和素磁微粒，利用長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體制得生物素化抗體，然后將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定，制得磁分離試劑； 所述酶反應(yīng)物包括堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體； 所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物，該多組分免疫復(fù)合物是按照以下方法制備得到的新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : I. 5 2.5 : O. 4 O. 6的體積比混合,加入硫酸銨沉淀過夜,離心，去上清,將沉淀溶于含O. 5 %牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，70 75°C放置O. 5 2小時(shí)，干燥，制得抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物； 所述化學(xué)發(fā)光底物為經(jīng)緩沖液稀釋的APS-5化學(xué)發(fā)光底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒還包括質(zhì)控品，該質(zhì)控品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到質(zhì)控品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優(yōu)選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，其中，所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的 將神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫蘇糖醇的PBS pH7. 2緩沖液中至O. 5mg/ml, 15分鐘后，加入終濃度為ImM賴氨酸反應(yīng)5 120分鐘； 將上述反應(yīng)物，按不同濃度用含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液稀釋成不同濃度點(diǎn)，并定標(biāo)，得到校準(zhǔn)品；所述含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液組分為磷酸二氫鈉50mM，氯化鈉 75mM，Tween 200. 02%, Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I %，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白 3%，Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉 pH 6.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，其中，所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的 磁性微粒與鏈霉親和素的偶聯(lián)取磁微粒，加入MES緩沖液中，加入sulfo-NHS、EDC，反應(yīng)，之后去上清，洗滌，再加入鏈霉親和素反應(yīng)過夜，制得鏈霉親和素磁微粒；更具體的操作可以是取250 μ I 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；去上清后加入20mM MES卩冊(cè).0緩沖液40(^ l,80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ l，25mg/ml EDC5 100 μ I，反應(yīng) 30分鐘；去上清，用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；加入2mg/ml鏈霉親和素150 1000 μ I反應(yīng)過夜； 長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體將神經(jīng)元特異性烯醇化酶捕獲抗體透析至PBS ρΗ7. 2緩沖液中，濃縮至2 10mg/ml，得抗體溶液；將Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩爾比I : 5 I : 100的比例在抗體溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反應(yīng)過夜；次日，透析至PBS pH7. 2緩沖液中，得生物素化抗體； 生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定將鏈霉親和素磁微粒用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至O. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至O. 5 20 μ g/ml的生物素化抗體I毫升，反應(yīng)4小時(shí)；加入含O. 03% TritonX100、l%蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2緩沖液5毫升；濃縮并真空干燥；再用含O. 15%酪蛋白、O. 5%的牛血清白蛋白、O. 2%Tween20、0. 02% Proclin300的PBS pH7. 2緩沖液復(fù)溶；制得磁分離試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，其中，所述酶反應(yīng)物是按照以下方法配制得到的 堿性磷酸酶標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體將堿性磷酸酶透析至PBS pH7. 2緩沖液中；將神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體透析至PBS pH6. 8緩沖液中；在堿性磷酸酶溶液中加入預(yù)先用二甲基亞砜溶解的SMCC溶液，反應(yīng)5分鐘后透析至PBS pH7. 2緩沖液，得活化的堿性磷酸酶溶液；在示蹤抗體溶液中加入預(yù)先用的用PBS pH6. 8緩沖液溶解的2-IT溶液，反應(yīng)15分鐘后,透析至PBS pH7. 2緩沖液,得活化的示蹤抗體溶液；將活化的堿性磷酸酶溶液和活化的示蹤抗體溶液混合，反應(yīng)過夜，得堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體； 將上述堿性磷酸酶標(biāo)記的神經(jīng)元特異性烯醇化酶示蹤抗體稀釋至如下組分的緩沖液中磷酸二氫鈉50mM、氯化鈉75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖1%、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋S O. 5%, Proclin 300 O. 02%、氫氧化鈉pH 6. 8，制得所述酶反應(yīng)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，其中，所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑是按照以下方法配制得到的 制備抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物將新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按1:2: O. 5的體積比混合；加入終濃度為57%的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；次日將處理后的混合血清離心,去上清,將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，放置于溫箱中，72°C放置I小時(shí)；用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至50mg/ml，分裝后冷凍干燥； 按如下配方配制穩(wěn)定增強(qiáng)劑磷酸二氫鈉50禮，氯化鈉75禮，三乙醇胺2%，多組分免疫復(fù)合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉pH6. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，其中，所述化學(xué)發(fā)光底物是按照以下方法配制得到的 按I : 4 10的比例將APS-5化學(xué)發(fā)光底物稀釋至下列組分的緩沖液中三乙醇胺2%，二乙醇胺O. 75%, CTAB2%, N，N-二甲二叮呢硝酸鹽O. 3%，牛血清白蛋白O. 15%,BronidoxO. 5%,鹽酸 ρΗ9· 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒還包括清洗液。
9.權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包括步驟 分別配制校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、以及化學(xué)發(fā)光底物； 將校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、化學(xué)發(fā)光底物獨(dú)立地置于包裝容器內(nèi)，得到神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒。
10.利用權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的試劑盒定量檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法，該方法包括步驟 -分別加30 μ I神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本至對(duì)應(yīng)試管底部； -加45 μ I酶反應(yīng)物至每一試管中； -加45 μ I穩(wěn)定增強(qiáng)劑至每一試管中； -加30 μ I磁分離試劑至每一試管中； -用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30S后，置37°C水浴15分鐘； -試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； -加清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻； -加200 μ I化學(xué)發(fā)光底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用，該試劑盒包括校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及化學(xué)發(fā)光底物；校準(zhǔn)品是采用還原劑溶液處理NSE抗原并稀釋至含非離子表面活性劑的緩沖液中制得；磁分離試劑是將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定制得；酶反應(yīng)物包括堿性磷酸酶標(biāo)記的NSE示蹤抗體；穩(wěn)定增強(qiáng)劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物。本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法以及應(yīng)用該試劑盒定量檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法。試劑盒性能可靠，靈敏度高，線性范圍寬，可配合全自動(dòng)儀器儀器使用。目前該試劑盒已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局診斷試劑三類注冊(cè)證。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102914650SQ201210199398
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者劉勁, 呂納新, 周昊, 張小平, 陳 峰, 趙鑫, 宋旭紅, 仲維新 申請(qǐng)人:北京大成生物工程有限公司