專利名稱：利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得二維電泳圖譜的方法，特別是一種利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法。
背景技術(shù)：
海參不但具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)還具有藥用價(jià)值，是被廣泛認(rèn)同的具有特殊滋補(bǔ)與營(yíng)養(yǎng)保健多重功效的海珍品。隨著人們對(duì)刺參需求量的增加，采捕強(qiáng)度逐漸增大，造成海參資源量急劇下降。同時(shí)，海參人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，海參種質(zhì)退化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重等一系列問(wèn)題，嚴(yán)重制約著海參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開(kāi)展海參的蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究，可以為海參的人工育苗繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)研究工作奠定基礎(chǔ)，研究結(jié)果將有助于提高海參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組研究的一個(gè)重要平臺(tái)，其三大核心技術(shù)分別為雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)。雙向電泳是最早的蛋白質(zhì)組研究工具，到目前為止，也是最重要的研究工具之一。它以蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量作為獨(dú)立參數(shù)，第一向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，對(duì)樣品進(jìn)行等點(diǎn)聚集分離，然后在第二向根據(jù)分子量大小用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，最終可獲得分辨率很高的二維圖譜，為后續(xù)蛋白質(zhì)的鑒定提供良好的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)可以在一塊凝膠上分辨出1800多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，能同時(shí)分析成百上千的基因表達(dá)產(chǎn)物。迄今為止，利用雙向電泳技術(shù)開(kāi)展的蛋白質(zhì)組研究工作在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有了一定的應(yīng)用。但目前在海洋水產(chǎn)方面的研究卻相對(duì)較少，只在泥蚶肌肉、大彈涂魚(yú)肝臟、鋸緣青蟹肌肉、蝦夷扇貝鰓、海兔肝臟、魚(yú)腥藻外膜蛋白、中華鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)總蛋白、鯉魚(yú)等品種開(kāi)展了相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種好操作、易控制的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，為刺參性別決定機(jī)制及繁殖育種工作提供技術(shù)條件和平臺(tái)，進(jìn)而提高刺參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本發(fā)明的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，步驟如下
a、刺參性腺總蛋白質(zhì)的制備
取刺參性腺并在液氮的低溫中將組織研磨成粉末，利用三氯醋酸丙酮法對(duì)粉末狀組織進(jìn)行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質(zhì)；
b、對(duì)上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定
采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定量試劑盒，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，其中包括標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和空白管的各個(gè)吸光度值，然后用公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量；所述的公式為
權(quán)利要求
1.一種利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其特征在于步驟如下 a、刺參性腺總蛋白質(zhì)的制備 取刺參性腺并在液氮的低溫中將組織研磨成粉末，利用三氯醋酸丙酮法對(duì)粉末狀組織進(jìn)行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質(zhì)； b、對(duì)上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定量試劑盒，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，其中包括標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和空白管的各個(gè)吸光度值，然后用公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量；所述的公式為
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其特征在于所述的利用三氯醋酸丙酮法對(duì)粉末狀組織進(jìn)行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質(zhì)步驟如下 將所述的粉末懸浮于裂解液中，所述的裂解液為丙酮溶液，其中含DTT和三氯醋酸，DTT占總體積的0. 2%，三氯醋酸占總體積的10% ； 在-20°C的條件下沉淀4h ;然后在4°C的條件下離心處理5min，轉(zhuǎn)速為12000rmp/min ；沉淀后重懸于含DTT的預(yù)冷丙酮中，其中DTT占液體總體積的0. 2% ；-20°C放置 Ih ； 在4°C的條件下離心處理30min，轉(zhuǎn)速為12000rmp/min ； 在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀； 在裂解液中重新溶解沉淀30min，每50-100mg組織需要Iml裂解液； 在4°C條件下離心處理30min，轉(zhuǎn)速為12000rmp/min ； 取上清即為刺參性腺可溶性蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其特征在于所述的等電聚焦電泳參數(shù)設(shè)置為電壓lOOOv，電流7mA，功率50w，時(shí)間3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其特征在于所述的平衡液成份如下P -巰基乙醇5ml、IM且pH 6.8的Tris-HCl.6.25ml、20%SDS 11. 5ml、甘油10ml、雙蒸水67. 25ml ;使用平衡液時(shí)加入溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)與平衡液的體積比為1:9 ;平衡時(shí)間為30 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其特征在于所述的SDS-PAGE電泳采用垂直電泳槽，利用DYY-10型電泳儀電泳，在上、 下槽中加入I倍的電泳緩沖液，以20 mA /膠板恒流電泳，直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部距膠邊緣約I cm處停止電泳；SDS-PAGE電泳中電壓為200V，電流為80mA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，步驟如下刺參性腺總蛋白質(zhì)的制備；對(duì)上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定；雙向電泳；染色；拍照得二維電泳圖譜。本發(fā)明的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，具有好操作、容易控制的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明所獲得的刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜為刺參性別決定機(jī)制及繁殖育種工作提供技術(shù)條件和平臺(tái)，進(jìn)而提高刺參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102721730SQ201210206058
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者常亞青, 湛垚垚, 田燚, 莫海波 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)