專利名稱：鉀離子濃度檢測試劑盒和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一種鉀離子濃度檢測試劑盒和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的鉀是維持細(xì)胞生理活動的主要陽離子，是保持機(jī)體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質(zhì)代謝，保證神經(jīng)肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動的重要指標(biāo)。尿液、血清中鉀離子的含量水平在臨床上可用了診斷一些腎臟、心臟等方面的疾 病。正常情況下，人體的鉀離子濃度有一個(gè)合理的參考范圍，如血清中3.5
5.5mmol/L ;尿液中25 125mmol/24h。當(dāng)鉀離子高于參考值，表現(xiàn)出高鉀癥，其原因主要有急性腎功能衰竭、嚴(yán)重溶血或組織損傷、急性酸中毒或組織缺氧、腎上腺皮質(zhì)功能減退、醛固酮缺乏、長期應(yīng)用利尿劑、家族性高血鉀等。血清鉀高還可引起嚴(yán)重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性應(yīng)激紊亂，以及特異的心電圖改變。血清鉀高于7mmol/L時(shí)，就有這些現(xiàn)象出現(xiàn)，超過lOmmol/L時(shí)，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而導(dǎo)致死亡。反之當(dāng)鉀的攝入量不足、鉀丟失嚴(yán)重、腎臟疾病轉(zhuǎn)入多尿期等情況時(shí)則會出現(xiàn)低鉀癥?，F(xiàn)有技術(shù)中測定鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質(zhì)譜法、化學(xué)測定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動力學(xué)法、原子分光光度法等。目前，臨床上經(jīng)常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時(shí)發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)參考法，優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標(biāo)準(zhǔn)法和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。外標(biāo)準(zhǔn)法一般操作誤差較大，不常采用。內(nèi)標(biāo)法是標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素進(jìn)行測定，一般是加入鋰內(nèi)標(biāo)，測定的是鋰/鉀電流的比值，而不是單獨(dú)鉀的電流，這樣，可減小燃?xì)夂突鹧鏈囟炔▌拥纫蛩匾鸬恼`差，因而有較好的準(zhǔn)確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專用儀器上進(jìn)行血清和尿液的鉀、鈉離子測定。因其具有標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是目前所有方法中最為簡便準(zhǔn)確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢。其原理是離子選擇電極是一種電化學(xué)傳感器，其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)對特定離子具有選擇性響應(yīng)的敏感膜電極，將離子活度轉(zhuǎn)換成電位信號，在一定范圍內(nèi)，其電位與溶液中特定離子活度的對數(shù)呈線性關(guān)系，通過與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測定過程又分為直接測定法和間接測定法，目前大部分采用間接測定法，由于間接測定法將待測樣本稀釋后測定，所測離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類有玻璃膜電極，感應(yīng)材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質(zhì)加壓成型；液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙烯作為感應(yīng)膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時(shí)問后，電極會老化，且價(jià)格昂貴。(3)化學(xué)測定法目前K+的化學(xué)測定主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進(jìn)行測定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子，從而可達(dá)到測出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測定鉀的原理是利用對丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變?yōu)槿樗嵬瑫r(shí)伴有還原型輔酶I的消耗，在波長340nm處測NADH的吸光度下降。(5)原子分光光度法也可用于檢測血清中鉀、鈉離子，但操作復(fù)雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種利用菁染料超分子與鳥嘌呤四鏈體(G-四鏈體)作用體系檢測鉀離子濃度的新方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鉀離子濃度檢測試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可利用紫外吸收光譜或熒光光譜儀器定量分析血清或尿液中鉀離子的濃度，測定過程不受鈉離子或其他微量元素的影響，精確度高。同時(shí)，由于該試劑靈敏度很高，對不同鉀離子濃度表現(xiàn)出顏色上的變化，肉眼可見，可實(shí)現(xiàn)可視化檢測。本發(fā)明的總體技術(shù)路線為通過加入鉀離子來調(diào)控G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成或構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨之菁染料識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)的變化，從而反映出鉀離子的濃度水平。具體為在沒有鈉離子及其他金屬陽離子存在的環(huán)境下，鉀離子促使單鏈的DNA序列轉(zhuǎn)變?yōu)镚-四鏈體結(jié)構(gòu)，隨著G-四鏈體結(jié)構(gòu)的生成，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上發(fā)生改變，達(dá)到肉眼觀測，同時(shí)在紫外吸收光譜及熒光光譜上也發(fā)生明顯的變化，吸光度及熒光強(qiáng)度的變化程度與鉀離子濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)定量反映鉀離子水平；或者在鈉離子存在的環(huán)境下，DNA序列形成反平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體，加入鉀離子反平行G-四鏈體則發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨著G-四鏈體構(gòu)象轉(zhuǎn)變，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上及紫外吸收光譜及熒光光譜上也發(fā)生明顯的變化，吸光度及熒光強(qiáng)度的變化程度與鉀離子濃度成正比，可定量反映鉀離子水平。本發(fā)明的第一方面提供一種檢測液體樣品中鉀離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟(I)用pH6. 2 8. 2的緩沖溶液配制鉀離子濃度不同的多個(gè)溶液樣本，其中每個(gè)所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子以及相同濃度的菁染料；(2)將所述多個(gè)溶液樣本置于紫外可見光吸收光譜儀或分光光度計(jì)下，檢測第一波長處的吸光度值及第二波長處的吸光度值，或者將所述多個(gè)溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用560nm的激發(fā)波長，檢測波長在第三波長處的熒光強(qiáng)度值，其中所述第一波長在560nm至590nm范圍，所述第二波長在500nm至540nm范圍，所述第三波長在580nm至640nm范圍；(3)以各個(gè)所述溶液樣本的鉀離子濃度作為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以步驟(2)中測得的第一波長處的吸光度值或第二波長處的吸光度值或者第一波長處的吸光度值與第二波長處的吸光度值的比值或者第三波長處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)作圖，從而獲得鉀離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)在待測液體樣品中加入能夠形成G-四鏈體的DNA分子、式I的化合物以及緩沖液，以使待測液體樣品中的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度、式I的化合物的濃度、以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液；(5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于紫外可見光吸收光譜儀或分光光度計(jì)下，檢測測試溶液在第一波長及第二波長處吸光度值，或者將所述測試溶液置于熒光光譜儀下，采用560nm的激發(fā)波長，檢測第三波長處的熒光強(qiáng)度值；(6)利用步驟(5)中測得的第一波長處的吸光度值或第二波長處的吸光度值或者第一波長處的吸光度值與第二波長處的吸光度值的比值或者第三波長處的熒光強(qiáng)度值在步驟(3)中獲得的鉀離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的測試溶液的鉀離子濃度值，然后通過待測樣品被的稀釋倍數(shù)計(jì)算出待測樣品的鉀離子濃度。 本發(fā)明的方法可以方便地用于檢測各種溶液樣品中的鉀離子濃度，例如，可以檢測人或動物血液、尿液或其他體液中的鉀離子濃度。
由于在人體或動物體中，除了鉀離子之外還存在許多其他金屬離子，特別是鈉離子的存在對本發(fā)明的方法的精確性會產(chǎn)生一定的影響。因此，本發(fā)明的第二方面提供一種在鈉離子背景下檢測液體樣品中鉀離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟(I)用pH6. 2 8. 2的緩沖溶液配制鉀離子濃度不同的多個(gè)溶液樣本，其中每個(gè)所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子、相同濃度的鈉離子以及相同濃度的菁染料；(2)將所述多個(gè)溶液樣本置于紫外可見光吸收光譜儀或分光光度計(jì)下，檢測所述溶液樣本在第一波長及第四波長處的吸光度值，或者將所述多個(gè)溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用560nm的激發(fā)波長，檢測波長在第三波長處的熒光強(qiáng)度值，其中所述第一波長在560nm至590nm范圍,所述第四波長在6 IOnm至670nm范圍,所述第三波長在580nm至640nm范圍；(3)以各個(gè)所述溶液樣本的鉀離子濃度作為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以步驟(2)中測得的各溶液樣本在第一波長處的吸光度值或第四波長處的吸光度值或者第一波長處的吸光度值與第四波長處的吸光度值的比值或者第三波長處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)作圖，從而獲得鉀離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)在待測液體樣品中加入能夠形成G-四鏈體的DNA分子、式I的化合物以及緩沖液，以使待測液體樣品中的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度、式I的化合物的濃度以及PH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液；(5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于紫外可見光吸收光譜儀或分光光度計(jì)下，檢測所述測試溶液在所述第一波長及所述第四波長處的吸光度值，或者將所述測試溶液置于熒光光譜儀下，采用560nm的激發(fā)波長，檢測波長在所述第三波長處的熒光強(qiáng)度值；(6)利用步驟(5)中測得的第一波長處的吸光度值或第四波長處的吸光度值或者第一波長處的吸光度值與第四波長處的吸光度值的比值或者第三波長處的熒光強(qiáng)度值在步驟(3)中獲得的鉀離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的測試溶液的鉀離子濃度值，然后通過待測樣品被的稀釋倍數(shù)計(jì)算出待測樣品的鉀離子濃度。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液或2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，對緩沖液中緩沖劑的濃度并不做特別的限定，但是優(yōu)選的濃度范圍為10 50mmol/L。根據(jù)本發(fā)明第一方面或第二方面的方法，其中所述菁染料為下式I的化合物
權(quán)利要求
1.一種檢測液體樣品中鉀離子濃度的試劑盒，其包括pH6. 2^8. 2的緩沖液、可溶性鉀鹽、能夠形成G-四鏈體的DNA分子和菁染料。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其還包括可溶性鈉鹽。
3.如權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其中所述菁染料為式I的化合物，
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述C1-CJ烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5獨(dú)立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述5元至7元環(huán)結(jié)構(gòu)為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)。
7.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。
8.權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液或2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液。
9.權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。
10.一種檢測液體樣品中鉀離子濃度的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括如權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的試劑盒和紫外可見光吸收光譜儀或分光光度計(jì)或熒光光譜儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測鉀離子濃度的試劑盒和系統(tǒng)。該試劑盒和系統(tǒng)利用鉀離子調(diào)控可形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的特性以及菁染料超分子聚集體識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的特性，特異性高，不受樣品中鈉離子的影響。試劑成分簡單，反應(yīng)過程簡單，可有效減少操作產(chǎn)生的誤差，測試精確度高。通過該試劑盒和系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)快速檢測，不需要特殊或額外儀器，檢測成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/64GK102735623SQ20121020772
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 姜薇, 孫紅霞, 尚倩, 楊千帆, 蓋偉 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所