專利名稱：一種快速高效測定葡萄酒中酚酸的方法
技術領域：
一種快速高效同時測定葡萄酒中13種酚酸的方法，屬于葡萄酒風味物質(zhì)分析技術領域。
背景技術：
酚酸類物質(zhì)是葡萄酒中一類重要的酚類化合物，這類化合物具有一個苯核，主要為對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸的衍生物，包括沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等。越來越多的研究表明，酚酸類物質(zhì)是一類具有獨特的保健作用的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基、抑制突變和抗腫瘤、抗血小板凝集、促進前列腺素的釋放、抗菌、抗病毒、止血、增高白血球，縮短血凝和出血時間等重要的生理功能。此外，酚酸與葡萄酒的品質(zhì)也有著密切的關系。在葡萄酒中，酚酸(如咖啡 酸、香豆酸等)可與花色素和酒石酸相結(jié)合，從而影響著葡萄酒的色度與顏色穩(wěn)定性。沒食子酸是主要的對羥基苯甲酸類酚酸，是葡萄酒中氧自由基清除能力的主要承擔者?？Х人崾侵饕膶αu基肉桂酸，同樣是葡萄酒中氧自由基清除能力的主要承擔者之一。葡萄酒中酚酸類物質(zhì)的研究一直是國內(nèi)外葡萄酒研究的一個熱點。目前，酚酸的分析測定方法主要有紫外法、薄層色譜法，高效液相色譜法(HPLC)，毛細管電泳法，氣相色譜法以及液質(zhì)、氣質(zhì)聯(lián)用等。紫外法由于樣品中伴隨著其他酚類物質(zhì)的存在，酚酸和其他酚類物質(zhì)等在相同波長下均有較強的吸收，因此測定值一般偏高；而紙層析法、薄層層析法在分離效果、速度、定量準確度等方面存在缺陷；氣相色譜法用于酚酸類物質(zhì)的分離，測定速度快，靈敏度高，但該方法需衍生化處理，前處理比較繁瑣，且不適于大分子質(zhì)量物質(zhì)；高效毛細管電泳法則存在著重現(xiàn)性較差、線性范圍窄和靈敏度較低等缺點。高效液相色譜法仍是目前應用最為廣泛的一種檢測方法，但利用HPLC檢測葡萄酒中酚酸仍存在檢測時間長，流動相消耗量大等缺點。陳建業(yè)等在《中國食品學報》2006年第6期的“葡萄酒中11種酚酸的反相高效液相色譜測定方法研究”公開了葡萄酒中酚酸的檢測，但只檢測到葡萄酒中11種酚酸物質(zhì)，檢測時間長達53分鐘，并且有部分物質(zhì)分離效果較差。目前基于HPLC的酚酸測定方法并不能快速高效的對葡萄酒中酚酸進行定性和定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有的酚酸測定方法存在成本高，檢測時間長等問題，提供了一種利用超高效液相色譜儀對葡萄酒中酚酸進行定性、定量分析的方法。本發(fā)明的技術方案一種快速高效測定葡萄酒中酚酸的方法，利用超高效液相色譜UPLC和二極管陣列檢測器同時對葡萄酒中13種酚酸進行定性和定量分析
所述檢測13種酚酸，分別為沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水楊酸；
(I)標準溶液配置分別精確稱取所述13種酚酸各10. 0-15. Omg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作為標準貯備液，在-20°C保存?zhèn)溆?；使用前，根?jù)實驗需要將此標準貯備液用甲醇稀釋至適宜含量，以配制標準工作液和混合標準工作液；
(2)葡萄酒樣品經(jīng)過O.45ΜΠ1濾膜過濾，用于進行檢測分析；
(3)超高效液相色譜分離檢測條件
檢測儀器Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀，包括四元溶劑管理器(QSM)，樣品管理器(SM-FTN)，色譜柱溫箱，光電二極管陣列檢測器(PDA)；色譜柱美國 Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18 色譜柱(100 mm X 2· I mm, I. 7μ m, Waters)，或同類 UPLC C18 色譜柱；
流動相A :乙酸水為2:98，v/v,即2%乙酸水；
流動相B:甲醇；
流速0. 3 mL/min ；
洗脫程序0-3. 2 min，A 為 92% -80%，B 為 8% -20% ;3· 2-8 min，A 為 80% -56%，B 為 20% -44% ；8-8. 2 min, A 為 56% -92%, B 為 44% -8% ；8. 2-10 min, A 為 92%，B 為8% ；
檢測波長龍膽酸為320 nm，其余均為280 nm ；
柱溫50°C，進樣量為I μ L，以峰面積外標法定量；
紫外檢測器的選擇選用二極管陣列檢測器；
(4)定性
對13種酚酸混合標準品進行色譜檢測，得到13種酚酸標準品色譜圖(如圖I所示);對葡萄酒樣品進行色譜檢測，得到葡萄酒樣品中13種酚酸的UPLC色譜圖(如圖2所示)。結(jié)果表明，13種酚酸標準品和葡萄酒樣品在上述色譜條件下，能夠充分分離；通過增高法進行定性分折；
用增高法進行定性，圖I所示的13種酚酸標準品出峰順序依次為沒食子酸(1，I. 157min)，原兒茶酸(2，I. 884 min)，龍膽酸(3，2. 826 min),對輕基苯甲酸(4, 2. 944 min),綠原@1(5,3. 455 min)，咖啡酸(6，3. 802 min)，香草酸(7，4. 028 min)，丁香酸(8，4. 729 min),香豆酸(9，5. 443 min)，阿魏酸(10，6. 387 min)，芥子酸(11，6. 679 min)，鞣花酸(12，7. 292min)，水楊酸(13，7. 558 min)。(5)定量
制作標準曲線準確配制O. 2-211. 2 mg/L的五個不同濃度的13種酚酸的混合標樣，標準品濃度的選擇依據(jù)為最終檢測葡萄酒樣品中13種酚酸含量在制作標準曲線的線性范圍內(nèi)。按照上述液譜條件進樣，進樣量為IuL;以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標，計算得到13條標準曲線；結(jié)果見表I。從表I中可知，13種酚酸標準品的溶液含量和檢測響應值呈現(xiàn)出良好的線性關系，并且最低檢測限都較低，表明此方法靈敏度較高。定量每種待測物質(zhì)分別對應于外標做標準曲線，經(jīng)過UPLC檢測后將峰面積代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質(zhì)的含量。表I 13種酚酸的保留時間、回歸方程和檢出限
權利要求
1.一種快速高效測定葡萄酒中酚酸的方法，其特征在于利用超高效液相色譜UPLC和二極管陣列檢測器同時對葡萄酒中13種酚酸進行定性和定量分析 所述檢測13種酚酸，分別為沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水楊酸； (1)標準溶液配置 分別精確稱取所述13種酚酸各10. 0-15. Omg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作為標準貯備液，在_20°C保存?zhèn)溆?；使用前，根?jù)實驗需要將此標準貯備液用甲醇稀釋至適宜含量，以配制標準工作液和混合標準工作液； (2)葡萄酒樣品經(jīng)過O.45ΜΠ1濾膜過濾，用于進行檢測分析； (3)超高效液相色譜分離檢測條件 色譜柱美國Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色譜柱或同類UPLC C18色譜柱 流動相A :乙酸水為2:98，v/v,即2%乙酸水； 流動相B:甲醇；流速0. 3 mL/min ； 洗脫程序0-3. 2 min，A 為 92% -80%，B 為 8% -20% ;3· 2-8 min，A 為 80% -56%，B 為 20% -44% ；8-8. 2 min, A 為 56% -92%, B 為 44% -8% ；8. 2-10 min, A 為 92%，B 為8% ； 檢測波長龍膽酸為320 nm，其余均為280 nm ； 柱溫50°C，進樣量為I μ L，以峰面積外標法定量； 紫外檢測器的選擇選用二極管陣列檢測器； (4)定性 對13種酚酸混合標準品進行色譜檢測，得到13種酚酸標準品色譜圖；對葡萄酒樣品進行色譜檢測，得到葡萄酒樣品中13種酚酸的UPLC色譜圖；通過增高法進行定性分折； (5)定量 制作標準曲線準確配制O. 2-211. 2 mg/L的五個不同濃度的13種酚酸的混合標樣，按照上述液譜條件進樣，進樣量為IuL;以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標，計算得到13條標準曲線； 定量每種待測物質(zhì)分別對應于外標做標準曲線，經(jīng)過UPLC檢測后將峰面積代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質(zhì)的含量。
全文摘要
一種快速高效測定葡萄酒中13種酚酸的方法，屬于葡萄酒風味物質(zhì)分析技術領域。本發(fā)明利用超高效液相色譜，對葡萄酒中的酚酸物質(zhì)進行定性和定量分析選取BEHC18色譜柱，流動相為2%乙酸水和甲醇，流速設定為0.3mL/min，紫外檢測波長龍膽酸為320nm，其余均為280nm，柱溫50℃，進樣量為1μL，以峰面積外標法定量，可以在10min內(nèi)同時對葡萄酒中13種酚酸進行檢測分析。本發(fā)明無需進行任何樣品前處理，避免因前處理導致的損失；與傳統(tǒng)HPLC相比，本發(fā)明可同時檢測出更多的酚酸類化合物，并且分離效果好，分析過程大大縮短，方便易操作，極大的提高了檢測效率及節(jié)省流動相成本。本發(fā)明為進一步系統(tǒng)研究葡萄酒中的風味物質(zhì)，提高葡萄酒品質(zhì)有重要意義。
文檔編號G01N30/06GK102721778SQ201210208958
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權日2012年6月25日
發(fā)明者唐柯, 徐巖 申請人:江南大學