專利名稱：致癌基因C-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤細(xì)胞中蛋白含量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種用于檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片及其檢測(cè)裝置。
背景技術(shù)：
C-myc基因是最早被發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細(xì)胞增殖活性相關(guān)的原癌基因產(chǎn)物之一，主要與Max蛋白形成雜合體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與特異性DNA序列結(jié)合，從而抑制或激活許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的改變。其過度表達(dá)易使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性表型，癌基因的活化或抑癌基因的失活均可啟動(dòng)或加速腫瘤的發(fā)生。因此在線檢測(cè)C-myc含量的變化，對(duì)于癌癥的預(yù)防、診治有著非常重要的意義。 目前用于檢測(cè)C-myc的方法主要有免疫組化法、原位雜交法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)、熒光微流珠陣列法等。這些方法多為生物學(xué)方法，且所使用儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、不適于在線檢測(cè)。與傳統(tǒng)的ELISA等方法僅能做到定性或半定量檢測(cè)相比，便攜、價(jià)廉的壓電石英晶體微天平因靈敏度高和選擇性好已廣泛用于生化分析領(lǐng)域，目前應(yīng)用壓電傳感技術(shù)檢測(cè)病原菌等微生物的專利有ZL200410023232. 5,ZL200710035069. 8,ZL201010550114. 5 等，但是應(yīng)用液相壓電免疫傳感手段檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的方法還沒有報(bào)道。因此本發(fā)明提供了一種基于自組裝傳感膜的單面起振的液相壓電免疫傳感芯片及其檢測(cè)裝置，可達(dá)到對(duì)癌變組織中C-myc重組蛋白含量的簡(jiǎn)便、快速、靈敏檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片及其檢測(cè)裝置，其特征在于利用免疫反應(yīng)結(jié)合引起壓電石英晶體振蕩頻率的變化來實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、定量地檢測(cè)癌變組織中C-myc重組蛋白的含量，即所述壓電免疫傳感芯片是通過固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體和C-myc重組蛋白的免疫反應(yīng)結(jié)合,引起壓電石英晶體振蕩頻率發(fā)生變化，與C-myc重組蛋白含量成線性響應(yīng)關(guān)系而達(dá)到檢測(cè)目的。為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
設(shè)計(jì)并制備了ー種用于檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述壓電免疫傳感芯片的組裝結(jié)構(gòu)自壓電石英晶體到最外層依次為壓電石英晶體片的未封閉的單面金膜、L-半胱氨酸單分子層、戊ニ醛單分子層、C-myc單克隆抗體。所述的壓電免疫傳感芯片的制備組裝過程是首先將壓電石英晶體片的一側(cè)單面金膜用與晶體直徑相當(dāng)?shù)木勐趣诚┧芰瞎?管壁厚度為O. I 2 mm，管高度為I 10 mm)和聚對(duì)苯ニ甲酸類塑料片(厚度為O. 01 O. 5 mm)通過環(huán)氧樹脂AB膠作粘連劑封閉在ー密閉空腔內(nèi)，即封閉了壓電石英晶體片的一側(cè)單面金膜，得到其另ー側(cè)未封閉的單面金膜；值得注意的是，壓電石英晶體的基頻為5 12 MHz，其振蕩形式為液相單面起振。然后，將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴在壓電石英晶體片未封閉的單面金膜表面浸潤(rùn)I 10 min，之后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗；將上述步驟處理的單面金膜置于I 100 mmol/L L-半胱氨酸(L_cys)中避光反應(yīng)]Λ 24 h,形成L-半胱氨酸單分子層，之后用pH=7. 4的10 mmol/L PBS緩沖溶液沖洗，以優(yōu)化L-半胱氨酸單分子層；隨后，將上述步驟處理的單面金膜置于O. I 10% (W/W)的戊ニ醛溶液中活化I 120 min,用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后就會(huì)在上述步驟處理的單面金膜表面形成戊ニ醛單分子層，再分別用O. I 10% (V/V)的こニ胺、O. I 10 mmol/L的巰基こ醇清洗上述步驟處理的單面金膜表面，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；將上述步驟處理的單面金膜于C-myc單克隆抗體中在37°C下溫育I 120 min，取出用PBS緩沖溶液沖洗，即得C-myc單克隆抗體修飾的壓電免疫傳感芯片。所述壓電免疫傳感芯片檢測(cè)裝置的組裝過 程是將溶液置于玻璃反應(yīng)池中，玻璃反應(yīng)池的底部放置ー個(gè)磁性攪拌磁子，并置于磁力攪拌器上，在玻璃反應(yīng)池的下端安裝一個(gè)放液管和ー個(gè)開關(guān)閥門；隨后，將壓電石英晶體片未封閉的單面金膜浸入溶液中，通過金電極引腳與TTL振蕩電路連接，TTL振蕩電路再與頻率計(jì)數(shù)器相連接，構(gòu)成ー個(gè)完整的傳感檢測(cè)回路，輸出信號(hào)接入計(jì)算機(jī)，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。當(dāng)C-myc單克隆抗體和C_myc重組蛋白免疫反應(yīng)結(jié)合后，引起所述壓電免疫傳感芯片的石英晶體的振蕩頻率發(fā)生變化，頻率變化值與待測(cè)C-myc重組蛋白含量在530 9600 pg/mL范圍內(nèi)成線性響應(yīng)關(guān)系,檢測(cè)下限達(dá)到530 pg/mL,可實(shí)現(xiàn)在線動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、快速定量檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的目的。同時(shí)，所述壓電免疫傳感芯片對(duì)癌變組織中C-myc重組蛋白含量能進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，其回收率達(dá)到96. 2% 108. 6%，在腫瘤疾病診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)方面具有十分重要的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的有益效果是，所述壓電免疫傳感芯片及其檢測(cè)裝置無須昂貴的儀器設(shè)備、酶或者放射性標(biāo)記物，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性和重現(xiàn)性好，且具有組裝簡(jiǎn)便，定量快速和在線監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可用于液相穩(wěn)定檢測(cè)，優(yōu)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(ELISA)。


圖I是單面封閉的壓電石英晶體片的平面結(jié)構(gòu)圖及其AA’剖面示意圖。圖2是傳感芯片的自組裝膜結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是傳感芯片的檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是傳感芯片石英晶體的頻率變化值與C-myc重組蛋白濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線圖，其在530 9600 pg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4內(nèi)插圖)方程可擬合為
AF = O. 00334C + 18. 733
其中Λ F表示頻率變化值(Hz)，C表示C-myc蛋白的濃度(pg/mL)。上述關(guān)系曲線圖是在室溫25°C時(shí)繪制的。圖1、2和3中，I.石英晶體未封閉的單面金膜，2. L-半胱氨酸單分子層，3.戊ニ醒單分子層，4. C-myc單克隆抗體,5. C_myc重組蛋白，6.被封閉的單面金膜,7.石英晶片，8.聚對(duì)苯ニ甲酸類塑料片，9.聚氯こ烯塑料管，10.金電極引腳，11.放液管，12.開關(guān)閥門，13.玻璃反應(yīng)池，14.攪拌磁子，15.磁力攪拌器，16. TTL振蕩電路，17.頻率計(jì)數(shù)器。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
壓電免疫傳感芯片的組裝制備
1)將8.O MHz壓電石英晶體片的 一側(cè)單面金膜用與晶體直徑相當(dāng)?shù)木勐趣诚┧芰瞎?管壁厚度為O. 5 mm,管高度為5 mm)和聚對(duì)苯ニ甲酸類塑料片(厚度為O. 02 mm)通過環(huán)氧樹脂AB膠作粘連劑封閉在ー密閉空腔內(nèi)，則其另一側(cè)未封閉的單面金膜可進(jìn)行傳感芯片的表面修飾；
2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=73的溶液)滴在上述壓電石英晶體片未封閉的單面金膜表面浸潤(rùn)2 min，之后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗；
3)將上述步驟處理的單面金膜置于20mmol/L L-半胱氨酸中避光反應(yīng)2 h，形成L-半胱氨酸單分子層，之后用pH=7. 4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，以優(yōu)化L-半胱氨酸單分子層；
4)將上述步驟處理的單面金膜置于2.5% (W/W)的戊ニ醛溶液中活化60 min，用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后就會(huì)在上述步驟處理的單面金膜表面形成戊ニ醛單分子層，再分別用5%(V/V)的こニ胺、I. O mmol/L的巰基こ醇清洗上述步驟處理的單面金膜表面，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；
5)將上述步驟處理的單面金膜于C-myc單克隆抗體中在37°C下溫育60min，取出后用PBS緩沖溶液沖洗，即得C-myc單克隆抗體修飾的壓電免疫傳感芯片。實(shí)施例2
C-myc重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
1)所用試劑(二次蒸餾水，PBS緩沖溶液)經(jīng)滅菌處理后均保存于4°C環(huán)境中備用；
2)取I.O μ L C-myc蛋白(抗原)置于I. 5 mL小試管中，用PBS溶液稀釋，分別配制成O 10 ng/mL的一系列溶液備用；
3)采用上述C-myc單克隆抗體修飾的傳感芯片分別測(cè)試各濃度的C-myc重組蛋白樣品，通過C-myc單克隆抗體和C-myc重組蛋白的免疫反應(yīng)結(jié)合,引起壓電石英晶體振蕩頻率發(fā)生變化，該頻率變化與C-myc重組蛋白含量成線性響應(yīng)關(guān)系以C-myc蛋白的濃度(pg/mL)為橫坐標(biāo),頻率變化值(Hz)為縱坐標(biāo),繪制測(cè)定C-myc重組蛋白樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4內(nèi)插圖)，通過C-myc對(duì)應(yīng)濃度的頻率變化值，即可測(cè)定出癌變組織樣品中的C_myc重組蛋白的含量；
4)測(cè)試完后，用O.I mol/L HCl溶液洗脫回復(fù)，再用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)施例3
肝癌組織中C-myc重組蛋白含量的測(cè)定
組織中蛋白的提取取0.2 g組織標(biāo)本，在4°C環(huán)境下用預(yù)冷的PBS沖洗干凈除去組織異物。用剪刀剪成O. 6 mm3小塊并加入配置好的I. O mL裂解液，再用PBS溶液稀釋備用。C-myc重組蛋白含量的測(cè)定將上述制備好的傳感芯片置于PBS緩沖溶液中，取上述稀釋后的樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，待頻率穩(wěn)定后記錄頻率變化值A(chǔ)FdE AF代入到擬合好的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可算出該肝癌組織樣品中C-myc重組蛋白的濃度值為2900 pg/mL。檢測(cè)結(jié)果表明肝癌組織中致癌基因C-myc高表達(dá)，與ELISA的檢測(cè)結(jié)果一致，且該芯片能進(jìn)行定量檢測(cè)，優(yōu)于ELISA方法，說明該方法能對(duì)癌變組織中的C-myc重組蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，具有通用性。實(shí)施例4
乳腺癌細(xì)胞中C-myc重組蛋白含量檢測(cè)
采集乳腺組織樣品，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，得到C-myc突變的腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)。培養(yǎng)條件L-15培養(yǎng)基，15% (胎?；蛐∨?血清，5%C02 , 37°C溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)上皮樣貼壁生長(zhǎng)。取O. 2 g組織標(biāo)本，在4°C的環(huán)境下用預(yù)冷的PBS沖洗干凈除去組織異物。用剪刀 剪成O. 6 mm3小塊并加入配置好的I. O mL裂解液，再用PBS稀釋備用。取上述稀釋后的樣品溶液，用所制備傳感芯片進(jìn)行測(cè)試，將頻率變化值代入到擬合好的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，可以算出乳腺癌細(xì)胞稀釋液中的C-myc含量為5400 pg/mL。檢測(cè)結(jié)果表明致癌基因C-myc高表達(dá)，與ELISA的檢測(cè)結(jié)果一致，且該芯片能進(jìn)行定量檢測(cè)，優(yōu)于ELISA方法，說明該方法能對(duì)癌變組織中的C-myc重組蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，具有通用性。實(shí)施例5
回收率的測(cè)定
本實(shí)施例測(cè)定所制備壓電免疫傳感芯片對(duì)不同濃度C-myc蛋白樣品的回收率，并與ELISA方法比較。在1%的鼠血清樣品中加入已知量的C-myc樣品溶液，然后測(cè)定各樣品的頻率變化值，計(jì)算Λ F，對(duì)照工作曲線找出濃度，比較測(cè)得的加入量和實(shí)際加入量，所得回收率在范圍96. 2%-108. 6%內(nèi)，而ELISA僅能做出定性檢測(cè)，說明本芯片優(yōu)于ELISA法，且回收率好，在致癌基因C-myc蛋白檢測(cè)方面具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例6 選擇性的測(cè)定
固定主響應(yīng)C-myc重組蛋白濃度為9500 pg/mL,增大干擾物質(zhì)濃度為主響應(yīng)蛋白濃度100倍，即干擾蛋白濃度為950 ng/mL。所考察的干擾蛋白分別為牛血清白蛋白、豬血紅蛋白、牛白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血紅蛋白、凝血酶、溶菌酶。當(dāng)C-myc重組蛋白的濃度為9500Pg/mL的時(shí)候，頻率變化值為50 ±2.0 Hz0當(dāng)加入濃度為響應(yīng)蛋白濃度100倍的干擾物吋，頻率變化的移動(dòng)偏差均在5%以內(nèi)，由此可見，上述蛋白物質(zhì)對(duì)C-myc單克隆抗體識(shí)別C-myc重組蛋白的過程不會(huì)產(chǎn)生明顯的干擾影響，說明所述壓電免疫傳感芯片對(duì)C-myc重組蛋白有很好的特異選擇性。實(shí)施例7 重現(xiàn)性的測(cè)定
本實(shí)施例測(cè)定所制備的壓電免疫傳感芯片對(duì)響應(yīng)不同濃度C-myc重組蛋白溶液的頻率變化值的重現(xiàn)性，對(duì)3200 pg/mL和9500 pg/mL的Ciyc重組蛋白樣品重復(fù)測(cè)定12次，獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3. 92%和I. 52%，說明所述壓電免疫傳感芯片有著良好的重現(xiàn)性，確保了所測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)致癌基因c-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述壓電免疫傳感芯片的組裝結(jié)構(gòu)自壓電石英晶體到最外層依次為壓電石英晶體片(7)未封閉的單面金膜(I)、L-半胱氨酸單分子層(2)、戊ニ醛單分子層(3)、C-myc單克隆抗體(4)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片的組裝制備過程如下 .1)首先將壓電石英晶體片(7)的一側(cè)單面金膜(6)用與晶體直徑相當(dāng)?shù)木勐趣诚┧芰瞎?9)和聚對(duì)苯ニ甲酸類塑料片(8)通過環(huán)氧樹脂AB膠作粘連劑封閉在ー密閉空腔內(nèi)，即封閉了壓電石英晶體片(7)的一側(cè)單面金膜(6)，得到其另ー側(cè)未封閉的單面金膜(I)； . 2)將Piranha溶液滴在上述壓電石英晶體片(7)未封閉的單面金膜(I)表面浸潤(rùn)I 10 min，之后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗；其中，Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 :3的溶液； . 3)將上述步驟處理的單面金膜(I)置于I 100mmol/L L-半胱氨酸中避光反應(yīng)f.24 h，形成L-半胱氨酸單分子層(2)，之后用pH=7. 4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，以優(yōu)化L-半胱氨酸單分子層(2); .4)將上述步驟處理的單面金膜(I)置于O.I 10% (W/W)的戊ニ醛溶液中活化I .120 min，用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后就會(huì)在上述步驟處理的單面金膜(I)表面形成戊ニ醛單分子層(3)，再分別用O. I 10% (V/V)的こニ胺、O. I 10 mmol/L的巰基こ醇清洗上述步驟處理的單面金膜(I)表面，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；. 5)將上述步驟處理的單面金膜(I)于C-myc單克隆抗體(4)中在37°C下溫育I 120min，取出用PBS緩沖溶液沖洗，即得C-myc單克隆抗體⑷修飾的壓電免疫傳感芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片的檢測(cè)裝置的組裝過程如下 .1)將溶液置于玻璃反應(yīng)池(13)中，玻璃反應(yīng)池(13)的底部放置ー個(gè)攪拌磁子(14)，并置于磁力攪拌器(15)上，在玻璃反應(yīng)池(13)的下端安裝一個(gè)放液管(11)和ー個(gè)開關(guān)閥門(12)； . 2)將壓電石英晶體片(7)未封閉的單面金膜(I)浸入溶液中，通過金電極引腳(10)與TTL振蕩電路(16)連接，TTL振蕩電路(16)再與頻率計(jì)數(shù)器(17)相連接，構(gòu)成ー個(gè)完整的傳感檢測(cè)回路。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片的檢測(cè)方法是通過固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體(4)和C_myc重組蛋白(5)的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起石英晶體振蕩頻率發(fā)生變化，與C-myc重組蛋白(5)含量成線性響應(yīng)關(guān)系而達(dá)到檢測(cè)目的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片上的聚氯こ烯塑料管的管壁厚度為O. I 2 mm，管高度為I 10 mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片上的聚對(duì)苯ニ甲酸類塑料片的厚度為O. 01 O. 5 mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片上的壓電石英晶體的基頻為5 12 MHz，其振蕩形式為液相單面起振。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體⑷的吸附量為I 1000 ng mじ1 mnT2。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的壓電免疫傳感芯片，其特征在于所述傳感芯片對(duì)癌變組織中C-myc重組蛋白(5)含量能進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，其回收率為96. 2 108. 6%，線性范圍為530 .9600 pg/mL,檢測(cè)下限達(dá)到 530 pg/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于石英晶體微天平(QCM)檢測(cè)致癌基因C-myc重組蛋白的壓電免疫傳感芯片及其檢測(cè)裝置。本發(fā)明是先封閉壓電石英晶體片(7)的一側(cè)單面金膜(6)，在其另一側(cè)未封閉的單面金膜(1)表面上組裝一層L-半胱氨酸單分子層(2)，之后再修飾上戊二醛單分子層(3)，通過戊二醛單分子層(3)的共價(jià)交聯(lián)作用，使其與C-myc單克隆抗體(4)結(jié)合，形成壓電免疫傳感芯片；然后通過C-myc單克隆抗體(4)和C-myc重組蛋白(5)的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起所述壓電免疫傳感芯片的石英晶體的振蕩頻率發(fā)生變化，以此來檢測(cè)癌變組織中C-myc重組蛋白(5)的含量。本發(fā)明的效果和益處在于所述壓電免疫傳感芯片具有組織簡(jiǎn)便、定量快速、靈敏度高、選擇性和再生性能好等優(yōu)點(diǎn)，可用于液相穩(wěn)定檢測(cè)，優(yōu)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(ELISA)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102692513SQ20121021250
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者何婧琳, 周婷, 宋鋮, 張玲, 曹忠, 李嬌, 田雁飛, 鄧婷 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙理工大學(xué)