專(zhuān)利名稱(chēng)：血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及血管緊張素I (Ang I )化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
高血壓(Hypertension)是一種世界性的常見(jiàn)疾病，世界各地的患病率高達(dá)109^20%，并可導(dǎo)致腦血管、心臟、腎臟的病變，是危害人類(lèi)健康的主要疾病。據(jù)衛(wèi)生部最新數(shù)據(jù)，我國(guó)現(xiàn)有高血壓患者2億多人，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平的提高，高血壓已日益成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
血管緊張素I (Angiotensin I ,Ang I )由腎素作用于血管緊張素原形成。腎素能催化血管緊張素原亮氨酸(Leu)與纈氨酸(Val)間的肽鍵水解產(chǎn)生十肽血管緊張素I。血管緊張素I在正常血漿濃度下沒(méi)有生物學(xué)活性，而是作為血管緊張素II的前體存在。血管緊張素I能刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素，它直接收縮血管的作用不明顯；血管緊張素II能使全身小動(dòng)脈收縮而升高血壓，此外，還可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，醛固酮作用于腎小管，起保鈉、保水、排鉀作用，從而引起血量增多，血壓升高。正常情況下，由于腎素分泌很少，血中血管緊張素也少，對(duì)血壓調(diào)節(jié)不起明顯作用。但當(dāng)大失血時(shí)，由于動(dòng)脈血壓顯著下降使腎血流量減少，血管緊張素生成增多，對(duì)防止血壓過(guò)度下降而使血壓回升卻起重要作用。腎血管長(zhǎng)期痙攣或狹窄的患者，因腎血流量減少，血管緊張素生成增多可導(dǎo)致腎性高血壓。此外，血管緊張素可引起血管強(qiáng)烈收縮，但在正常情況下不參與血壓調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體處于失血等情況而使循環(huán)血量減少時(shí)，該激素在血中濃度將顯著升高，對(duì)保持循環(huán)血量和維持動(dòng)脈血壓起一定作用.目前對(duì)血管緊張素I目前臨床上常用的測(cè)定血管緊張素I的方法是放射免疫分析技術(shù)(RIA)和酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)，但是這兩種方法存在諸多不足，例如RIA存在放射性污染、標(biāo)記物半衰期短、對(duì)操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)；而ELISA靈敏度低，檢測(cè)范圍窄；隨著標(biāo)記免疫技術(shù)的迅速發(fā)展，各種新的檢測(cè)方法層出不窮，例如ELISA方法、時(shí)間分辨免疫分析法、免疫熒光法、化學(xué)發(fā)光發(fā)等。其中，化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是將化學(xué)發(fā)光和酶免疫分析結(jié)合在此技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，起步于80年代初，在90年代得到了快速發(fā)展和應(yīng)用，是當(dāng)今最為敏感的微量免疫測(cè)定法，具有靈敏度高(檢測(cè)極限10_17-10-19)、可測(cè)定物質(zhì)濃度范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定性好、安全無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，目前以廣泛應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為取代RIA和ELISA的首選技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供血管緊張素I的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法，解決了靈敏度低，檢測(cè)范圍窄的缺陷。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒包括Ang I抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I、Ang I校準(zhǔn)品、Ang I質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。所述的血管緊張素I抗體包被板的固相載體為96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的辣根過(guò)氧化物酶純度要求RZ彡3. 0,活性彡250U/mL。所述的發(fā)光液A包含0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚；發(fā)光液B包含0.675g/L過(guò)氧化脲。所述的20倍濃縮洗液包括75. 5g/L Tris, 120g/LNaCl,5mL/L Tween-20,lg/LProclin300。一種制備上述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟DAng I抗體包被板制備將Ang I抗體用pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至l_10ug/mL，在每個(gè)微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過(guò)夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對(duì)微孔板進(jìn)行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang I抗體包被的微孔板； 2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ang I，得Ang I酶結(jié)合物；利用高碘酸鈉氧化法，將Ang I與辣根過(guò)氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I ；3) Ang I 校準(zhǔn)品；將Ang I抗原用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成系列濃度(濃度分別為0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL)，于2 8°C保存?zhèn)溆谩?)Ang I質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang I純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為0. 46ng/mL和10. 35ng/mL。5)配制發(fā)光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1緩沖液為液是濃度為0. 675g/L的過(guò)氧化脲，用工藝用水配制。6)配制20倍濃縮洗液；20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;其中包括發(fā)光液A、發(fā)光液B、20倍濃縮洗液、Ang I酶結(jié)合物各I瓶，Ang I包被板I塊，Ang I校準(zhǔn)品6瓶、Ang I質(zhì)控品2瓶。8)對(duì)采用該方法制得的試劑盒進(jìn)行物理檢查，并對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)的線(xiàn)性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)一步所述的包被板為包被有Ang I抗體的96孔或48孔白色微孔板。本發(fā)明方法制備的試劑盒采用如下具體形式，其包括血管緊張素I抗體包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I抗原、不同濃度的Ang I校準(zhǔn)品、發(fā)光液A液為魯米諾和對(duì)碘酚、發(fā)光液B液為過(guò)氧化脲、20倍濃縮洗液為配方為75. 5g/LTris,120g/L NaCl,5mL/LTween-20,lg/LProclin300。ProClin300以其廣譜活性、優(yōu)越的兼容性和穩(wěn)定性及其在使用濃度下的低毒性，ProClin300成為用于診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin300防腐劑可在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)根除細(xì)菌、真菌及酵母，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對(duì)大多數(shù)的酶或抗體交聯(lián)反應(yīng)的功能無(wú)影響，所以不會(huì)干擾檢驗(yàn)指示劑。本專(zhuān)利發(fā)明的血管緊張素I定量檢測(cè)試劑盒，采用目前最為敏感的免疫測(cè)定方法——化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，具有以下有點(diǎn)(I)本試劑盒利用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)測(cè)定血漿樣本。操作簡(jiǎn)便，適用于臨床常規(guī)檢測(cè)；(2)靈敏度高，分析靈敏度不高于0. 05ng/mL；(3)本產(chǎn)品的特異性良好，與血管緊張素II及血管緊張素1-7的交叉特異性均小于1%;(4)精密度良好，批內(nèi)精密度不高于15%，批間精密度不高于20% ；(5)穩(wěn)定性良好，本產(chǎn)品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年；(6)特異性強(qiáng)，反應(yīng)快速，可在65分鐘內(nèi)判斷檢測(cè)結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，安全無(wú)環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測(cè)樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。性能優(yōu)于國(guó)內(nèi)同類(lèi)產(chǎn)品，達(dá)到了國(guó)際先進(jìn)水平，成本較國(guó)外的產(chǎn)品低。


圖I是本發(fā)明的博奧賽斯化學(xué)發(fā)光試劑盒測(cè)定Ang I與放免試劑盒測(cè)定Ang I的測(cè)定結(jié)果比較圖，其中縱坐標(biāo)為博奧賽斯測(cè)得的Ang I值，橫坐標(biāo)為放免試劑盒測(cè)定Ang I 值，兩種方法相關(guān)系數(shù)(r) =0. 9477，直線(xiàn)方程y=0. 9772x+0. 041。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :制備血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括Ang I抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I、Ang I校準(zhǔn)品、Ang I質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。通過(guò)下述方法制備血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒(I)包被JfAng I抗體加到碳酸鹽緩沖液(pH=9. 6)中混勻，在每個(gè)微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過(guò)夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對(duì)微孔板進(jìn)行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang I抗體包被的微孔板。(2)利用高碘酸鈉氧化法，將Ang I與辣根過(guò)氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I。高碘酸鈉氧化法的具體步驟如下a將HRP溶于蒸餾水中，加入等體積的新配制的0. 06M NaI04水溶液，混勻后于冰箱中放置30min，然后與HRP等體積的0. 16M乙二醇，于室溫下放置30min。b加入與HRP等量的Ang I，混勻后裝入透析袋，對(duì)0. 05M pH9. 5的碳酸緩沖液在4°C下透析過(guò)夜,然后加入5mg/mL的NaBH4,于冰箱中放置2h。c將上述混合液加入等體積的飽和硫酸銨溶液，于冰箱中放置30min后離心。d得到的沉淀物溶于少許0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液中，透析過(guò)夜后，加入等體積的甘油于-20°C下貯存?zhèn)溆谩?) Ang I 校準(zhǔn)品；將Ang I抗原用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成系列濃度(濃度分別為0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL)，于2 8°C保存?zhèn)溆谩?)Ang I質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang I純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為0. 46ng/mL和10. 35ng/mL。 5 )配制發(fā)光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1緩沖液為液是濃度為0. 675g/L的過(guò)氧化脲，用工藝用水配制。6)配制20倍濃縮洗液；20倍濃縮洗液的配制方法如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/LTween_20，lg/LProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;其中包括發(fā)光液A、發(fā)光液B、20倍濃縮洗液、Ang I酶結(jié)合物各I瓶，Ang I包被板I塊，Ang I校準(zhǔn)品6瓶、Ang I質(zhì)控品 2瓶。8)對(duì)采用該方法制得的試劑盒進(jìn)行物理檢查，并對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)的線(xiàn)性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。說(shuō)明指標(biāo)檢測(cè)準(zhǔn)確性試劑盒校準(zhǔn)品與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品系列同時(shí)進(jìn)行分析測(cè)定，用Log (X) -Logit (Y)數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)不明顯偏離平行(t檢驗(yàn)，111〈2. 447);以Ang I企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值比值的平均值應(yīng)在0. 9(Tl. 10范圍內(nèi)。企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的配制將高純度的Ang I用稀釋液(含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液)稀釋為系列梯度，經(jīng)WHO標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC編號(hào)86/536)標(biāo)定，其濃度分別為0. 2,0. 5、2、5、12ng/mL，并以不含Ang I的稀釋液作為零值對(duì)照。劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)的線(xiàn)性用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，劑量_反應(yīng)曲線(xiàn)在(Tl2ng/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r絕對(duì)值不低于0. 9900。分析靈敏度分析靈敏度不高于0. 05ng/mL。精密度批內(nèi)不精密度(CV%)應(yīng)不高于15.0%;批間不精密度(CV%)應(yīng)不高于20. 0%。質(zhì)控品測(cè)定值平行測(cè)定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，質(zhì)控品測(cè)值應(yīng)在允許范圍內(nèi)，QcL和QcH的允許范圍分別為0. 37 0. 55ng/mL和8.28 12. 42ng/mL。特異性交叉反應(yīng)應(yīng)符合下表要求。
權(quán)利要求
1.血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:AngI抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I、Ang I校準(zhǔn)品、Ang I質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的血管緊張素I抗體包被板為包被有Ang I抗體的96孔或48孔白色微孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的辣根過(guò)氧化物酶純度要求RZ ^ 3. 0，活性> 2 50U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的Ang I質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和高質(zhì)質(zhì)控品，其中低值質(zhì)控品的濃度范圍是0.37 0. 55ng/mL,高質(zhì)質(zhì)控品的濃度范圍是8. 28 12. 42ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光液A包含0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚；發(fā)光液B包含0. 675g/L過(guò)氧化脲。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的 20 倍濃縮洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300。
7.一種制備所述權(quán)利要求I的試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 1)Ang I抗體包被板制備 將Ang I抗體用pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，在每個(gè)微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過(guò)夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對(duì)微孔板進(jìn)行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang I抗體包被的微孔板； 2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記AngI ,得Ang I酶結(jié)合物； 利用高碘酸鈉氧化法，將Ang I與辣根過(guò)氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ang I ； 3)Ang I校準(zhǔn)品； 將Ang I用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成系列濃度，濃度分別為0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL，于2、°C保存?zhèn)溆茫? 4)AngI質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang I純品，配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其濃度的平均值分別為0. 46ng/mL和10. 35ng/mL ； 5)配制發(fā)光液A液和B液 A液是含有0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS HCl緩沖液；B液是濃度為0. 675g/L的過(guò)氧化脲，用工藝用水配制； 6)配制20倍濃縮洗液 20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300 ； 7)組裝 將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ; 8)對(duì)采用該方法制得的試劑盒進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)的線(xiàn)性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的包被板為包被有Ang I抗體的96孔或48孔白 色微孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括AngⅠ抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的AngⅠ、AngⅠ校準(zhǔn)品、AngⅠ質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。另外本發(fā)明還公開(kāi)了一種血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比操作簡(jiǎn)便，安全無(wú)環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測(cè)樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102749456SQ20121021401
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者劉萍, 宋啟超, 張影, 范利花 申請(qǐng)人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司