專利名稱：一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器(MIES)的制備方法。
背景技術(shù)：
枸櫞酸西地那非是第一個(gè)口服治療陽(yáng)痿的藥品，需在醫(yī)生指導(dǎo)下使用。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局規(guī)定所有含枸櫞酸西地那非的食品均不合法，它 與硝酸甘油藥物有絕對(duì)的禁忌癥，特別是對(duì)于患有高血壓心絞痛而服用硝酸甘油的患者，一旦長(zhǎng)期服用會(huì)造成血壓疊加下降，對(duì)生命安全造成嚴(yán)重威脅。目前一些不法生產(chǎn)企業(yè)在保健食品、中成藥中添加極少量的枸櫞酸西地那非，使其具有抗疲勞、補(bǔ)腎壯陽(yáng)等作用，但為了逃避法律的制裁并沒(méi)有明示產(chǎn)品的潛在危害。為保證廣大消費(fèi)者的身體健康，規(guī)范保健食品市場(chǎng)，建立一個(gè)靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢驗(yàn)枸櫞酸西地那非的檢測(cè)方法是非常必要而又迫切的問(wèn)題。目前各種新型檢測(cè)分析儀器，特別是帶有質(zhì)譜檢測(cè)器的氣相色譜和液相色譜在適用性和靈敏度方面都有很大的提高。但由于保健食品、中成藥品中違禁添加的藥物成分多且含量極低，復(fù)雜基質(zhì)成分間(尤其是復(fù)方中藥成分)相互干擾等在，導(dǎo)致目前各種檢測(cè)方法大部分存在樣品制備方法繁雜、缺乏選擇性等問(wèn)題，因此對(duì)于功能保健食品和藥品中違禁藥物檢測(cè)新技術(shù)的研究具有極為重要的意義。電化學(xué)傳感器是一種重要的電子器件，因其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、靈敏度高、價(jià)格低廉、可實(shí)現(xiàn)人體檢測(cè)、可滿足臨床診斷、環(huán)境分析、食品分析和產(chǎn)品檢測(cè)需要等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人 \ 3的關(guān)注。分子印記屬于超分子化學(xué)中主客體化學(xué)范疇，是源于高分子化學(xué)和材料化學(xué)等學(xué)科的一門綜合學(xué)科。分子印記技術(shù)是制備具有特異選擇性或?qū)Ｒ贿x擇性聚合物的技術(shù)。其最顯著的三大特點(diǎn)為構(gòu)效預(yù)定性，特異識(shí)別性和廣泛適用性。目前電聚合分子印記傳感器敏感膜具有一定報(bào)道，用電聚合方法制備西地那非分子印記敏感膜傳感器未見(jiàn)報(bào)道。用分子印記方法富集檢測(cè)保健品中違禁添加的西地那非已有文獻(xiàn)報(bào)道。丁美娟等利用Fe3O4作為磁性材料，研究出了一種磁性分子印記技術(shù)用來(lái)檢測(cè)中成藥中的西地那非及伐地那非含量，Pawet D^giel等人利用固相萃取技術(shù)研究了一種在水溶液中即可檢測(cè)血漿中西地那非含量的方法。保健品特別是中藥類保健品由于自身成分的復(fù)雜性，以及添加違禁藥物種類的多樣性和未知性等問(wèn)題，對(duì)其含有西地那非的分析檢測(cè)提出了更高的要求。已有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法有HPLC、毛細(xì)管電泳法、LC-MS等。這些傳統(tǒng)的方法雖然也能實(shí)現(xiàn)對(duì)西地那非的測(cè)定，但往往由于樣品基質(zhì)復(fù)雜而需要經(jīng)過(guò)繁瑣的樣品前處理，這大大影響了目標(biāo)物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和快捷性。結(jié)合分子印記技術(shù)的優(yōu)良選擇性進(jìn)行樣品前處理可實(shí)現(xiàn)痕量目標(biāo)物的快速富集。曾有報(bào)道以分子印記技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分析方法檢測(cè)復(fù)雜樣品中的西地那非，雖然大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性但仍然面臨樣品處理復(fù)雜、耗時(shí)的缺點(diǎn)。電化學(xué)傳感器最大的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高、方便快捷，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。傳統(tǒng)的電化學(xué)檢測(cè)多數(shù)局限于本身具有電化學(xué)活性的待測(cè)物，與分子印記相結(jié)合的電化學(xué)傳感器有望突破傳統(tǒng)的局限，可通過(guò)待測(cè)目標(biāo)物與特異性孔穴結(jié)合阻塞探針?lè)肿拥耐樊a(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)。但電聚合到電極上的分子印記層多為不導(dǎo)電或弱導(dǎo)電物質(zhì)，大大影響了傳感器的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，該法首次結(jié)合電化學(xué)傳感器與分子印記技術(shù)的優(yōu) 點(diǎn)構(gòu)筑西地那非分子印記電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)保健品、藥品中違禁添加西地那非的快速檢測(cè)，它不僅能維護(hù)廣大消費(fèi)者的合法權(quán)益，而且能更好地保障他們的身體健康安全，從而使廣大消費(fèi)者在對(duì)補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中藥保健品的選購(gòu)方面具有更加清晰的認(rèn)識(shí)，這對(duì)完善我國(guó)藥事管理與法規(guī)，規(guī)范藥品生產(chǎn)企業(yè)的行為，凈化中藥保健品市場(chǎng)具有極為重要的推動(dòng)作用。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其包括以下步驟a)電極預(yù)處理將玻碳電極拋光后清洗；b)分子層層自組裝修飾電極將預(yù)處理后的電極浸入到含TODA的水溶液中，進(jìn)行靜電吸附后用沖洗干凈并吹干；再將其浸入至帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS-RGO溶液，浸潰后洗凈、吹干；繼續(xù)浸入到帶正電的氧化還原石墨烯TODA-RGO溶液中，浸潰后洗凈、吹干；重復(fù)前述浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS-RGO溶液和帶正電的氧化還原石墨烯PDDA-RGO溶液的步驟，以每RG07RG0+為一層，重復(fù)浸潰10 20層，得到10 20層RGO的分子層層自組裝修飾電極；c)分子印記自組裝溶液配制含苯二胺類功能單體和西地那非的乙醇/HAC-NaAC緩沖液，將其用氮?dú)獬鹾竺芊猓?0°C 30°C避光環(huán)境中放置5 20h，得到分子印記自組裝溶液。其中，西地那非和苯二胺類功能單體的摩爾濃度比為1:1 1:50 ；d)電聚合反應(yīng)將步驟c)得到的分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)容器中，避光，通氮?dú)夂?，插入步驟b)得到的RGO層層自組裝修飾的玻碳電極，于+0. 2^1. OV電位下，采用計(jì)時(shí)電流電聚合400 800s，取出，淋洗、吹干；e)洗脫模板分子將步驟d)得到的電極浸AH2SO4溶液中，在-0.8O.2V電位下處理:TlOmin。在步驟a)中，玻碳電極拋光后可先依次用乙醇和水超聲清洗，然后用雙蒸水淋洗并用氮?dú)獯蹈?。在步驟b)中，處理后的電極浸入到含TODA (聚二烯丙基二甲基氯化銨)的水溶液中靜電吸附的時(shí)間為4 6h ;靜電吸附后采用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?；所述TODA的水溶液的質(zhì)量濃度為O. 59Γ5. 0%。在步驟b)中，將電極浸入至帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS(4_苯乙烯磺酸鈉)-RG0(氧化還原石墨烯)溶液的時(shí)間為l(T60min;浸潰后采用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?。所述PSS-RGO溶液中RGO的摩爾濃度范圍為O. lmg/mL 5. Omg/mL,優(yōu)選O. 5mg/mL I. Omg/mL。本發(fā)明中PSS-RGO可采用現(xiàn)有方法制備，如呂偉的[石墨烯的低溫制備及電化學(xué)性質(zhì)研究](參考文獻(xiàn)[1])以及 He W 等人的[An efficient reduction route for theproduction of Pd-Pt nanoparticles anchored on graphene nanosheets for use asdurable oxygen reduction electrocatalysts](參考文獻(xiàn)[2]X步驟b)中，電極浸入到帶正電的氧化還原石墨烯I3DDA-RGO溶液中的時(shí)間為l(T60min ;浸潰后用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?。所述TODA-RGO溶液中RGO的摩爾濃度范圍為 O. lmg/mL 5. Omg/mL，優(yōu)選 0. 5mg/mL L 0mg/mLo本發(fā)明中PSS-RGO可采用現(xiàn)有方法制備，如采用呂偉的[石墨烯的低溫制備及電化學(xué)性質(zhì)研究](參考文獻(xiàn)[1])以及He W等人的[An efficient reduction route forthe production of Pd-Pt nanoparticles anchored on graphene nanosheets for useas durable oxygen reduction electro catalysts](參考文獻(xiàn)[2])。步驟b)可得到 PDDA/ (RGOVRGOV'' '/RG07RG0+/) 10^20GCE 電極，即 10 20 層RGO層層自組裝修飾的玻碳電極。在步驟c)中，所述苯二胺類功能單體為鄰苯二胺、對(duì)苯二胺或間苯二胺；西地那非和苯二胺類功能單體的摩爾濃度比為I: I 1:50。其中西地那非的濃度范圍為0. Immol/L 5. 0mmol/L ;苯二胺類功能單體的濃度范圍為5. 0mmol/L、0. 0mmol/L。單體與模板分子的摩爾比直接影響分子印記膜中印記孔穴的形成及識(shí)別位點(diǎn)的量，進(jìn)而影響其吸附性能。在自組裝過(guò)程中，西地那非與對(duì)苯二胺通過(guò)氫鍵作用選擇性結(jié)合，使MIS對(duì)目標(biāo)物有更好的選擇性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)洗脫前后電流響應(yīng)值的變化，當(dāng)摩爾比為1:5 1:20，特別是1:10時(shí)，MIS電流響應(yīng)變化值最大。在步驟d)中，分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)容器后避光通氮?dú)獾臅r(shí)間為l(T30min。步驟d)中采用計(jì)時(shí)電流電聚合方式，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較過(guò)西地那非標(biāo)準(zhǔn)自組裝液分別采用循環(huán)伏安電聚合法與計(jì)時(shí)電流電聚合法進(jìn)行電聚合成膜，對(duì)比它們電聚合洗脫前后電流響應(yīng)值的變化。結(jié)果顯示，計(jì)時(shí)電流法電聚合形成的分子印記聚合膜洗脫模板分子后電流響應(yīng)值明顯大于循環(huán)伏安法電聚合洗脫后的電流響應(yīng)值。在步驟e)中，采用H2SO4溶液對(duì)模板分子進(jìn)行洗脫。模板分子是否徹底洗脫對(duì)電極的測(cè)定結(jié)果有著重要的影響。傳統(tǒng)的洗脫方法往往采用有機(jī)溶劑或緩沖溶液淋洗電極，這些方法一般需要的時(shí)間長(zhǎng)，且不能夠完全除去模板分子。測(cè)試電位對(duì)苯二胺-西地那非之間結(jié)合力的影響，以探索洗脫模板分子的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)對(duì)分子印記聚合膜施加一定正電壓洗脫，洗脫后模板分子的印記孔穴重現(xiàn)性不好，且洗脫效果不夠明顯?？赡苁怯捎谠谡妷壕酆舷乱l(fā)形成的聚合物膜對(duì)正電位穩(wěn)定。但施加負(fù)電位時(shí)情況則不同，負(fù)電位可通過(guò)改變質(zhì)子化對(duì)苯二胺與西地那非復(fù)合物內(nèi)部的微環(huán)境而降低兩者之間的氫鍵結(jié)合力，迫使模板分子從高度聚合的對(duì)苯二胺內(nèi)部離開(kāi)達(dá)到洗脫目的。本發(fā)明根據(jù)靜電斥力和氫鍵在酸性溶液中易斷裂的機(jī)理，將電聚合后電極浸AH2SO4溶液中，在-I. (Γ+0. 2V電位下處理3 10min使聚合膜上形成負(fù)電荷聚集，優(yōu)選在_0. 8^+0. 2V電位下處理，進(jìn)一步優(yōu)選在-0. 8'0. 2V電位下處理。本步驟中采用的H2SO4溶液的濃度范圍為0. 2mol/L 2. Omol/L0可通過(guò)以下方法對(duì)本發(fā)明電化學(xué)傳感器進(jìn)行檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè)方法和條件循環(huán)伏安法(CV)法檢測(cè)電位范圍為-0. 2 0. 6V，掃描速率為IOOmV s'測(cè)試底液為 0. Imol · L-1KCl 和 Immol · T1K3Fe (CN) 6 溶液。差示脈沖法(DPV)法檢測(cè)電位范圍為-0. 4 0. 6V，掃描速率為50mV .s—1,電位增量為O. 005V，振幅為O. 05V，脈沖寬度為O. ls，采樣寬度為O. 02s，靜止時(shí)間為2s。測(cè)試前電極在H2SO4溶液中清洗至背景電流恢復(fù)。測(cè)試底液為O. Imol -L^iKCI和lmmol -L^1K3Fe (CN)6溶液。交流阻抗法(EIS):初始電位200mV，頻率范圍O. 01 10000Hz，測(cè)試底液為O. Imol · L 1KCl 和 Immol · L 1K3Fe(CN)6 溶液。樣品測(cè)定以測(cè)定片劑中的 西 地那非為例，取某補(bǔ)腎強(qiáng)身片(規(guī)格O. 28g/片)5片，用研缽研磨充分,稱取粉末IOOmg,以IOmL乙腈超聲萃取20min。過(guò)濾后取濾液ImL,氮?dú)獯蹈珊蠹尤雙H5. 6的磷酸鹽緩沖液，采用上述中的DPV法測(cè)定三份樣品中西地那非的濃度。西地那非為有機(jī)弱堿，在堿性溶液中不溶。經(jīng)測(cè)試，當(dāng)緩沖溶液的PH為5. 6時(shí)，洗脫模板分子后電流響應(yīng)值最高，說(shuō)明在此條件下對(duì)苯二胺與西地那非之間形成了更多的印記位點(diǎn)，識(shí)別效果最好。故樣品測(cè)定時(shí)溶液的酸度應(yīng)在能保證西地那非完全溶解的情況下盡量低。本方法制備的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器，其檢測(cè)限(LOD)可達(dá)到2.0X10_8mol -Γ1 (S/N=3)，靈敏度遠(yuǎn)高于現(xiàn)有已報(bào)道的傳感器，其還具有選擇性高、響應(yīng)快速、穩(wěn)定性和耐受性良好等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中西地那非的高效、靈敏和實(shí)時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果I.本發(fā)明通過(guò)分子層層自組裝將帶相反電荷的RGO交替吸附到電極表面，這大大增加了電極的比表面積，增強(qiáng)了電子傳導(dǎo)能力，提高了檢測(cè)靈敏度。2.帶相反電荷的RGO通過(guò)層層自組裝，能夠使每一層的納米氧化還原石墨烯分子吸附均勻牢固，層數(shù)可控，通過(guò)控制層數(shù)可方便觀察電化學(xué)響應(yīng)的變化。3.將分子印記與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提高了電化學(xué)傳感器的專屬性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中西地那非的選擇性檢測(cè)。4.分子印記層通過(guò)自組裝后再進(jìn)行電聚合，形成了致密牢固包含模板分子的特異性孔穴膜層。5.選用的功能單體為苯胺類物質(zhì)，既是功能單體又是傳統(tǒng)分子印記中的交聯(lián)劑，在電聚合條件下形成導(dǎo)電性的聚苯胺。


圖I是MIES制備過(guò)程中各階段循環(huán)伏安對(duì)比圖。圖中，al為裸-GCE的CV曲線、bl石墨烯LBL-GCE的CV曲線、cl電聚合后MIPs的CV曲線、dl洗脫模板分子MIES的CV曲線。圖2是MIES制備過(guò)程中各階段交流阻抗對(duì)比圖。圖中，a2為裸-GCE的CV曲線、b2石墨烯LBL-GCE的CV曲線、c2電聚合后MIPs的CV曲線、d2洗脫模板分子MIES的CV曲線。圖3是LBL-MIES的動(dòng)態(tài)吸附曲線圖。圖4是LBL-MIES和LBL-NIES的靜態(tài)吸附曲線圖。圖5是LBL-MIES的選擇性吸附曲線。圖中，a :1 μ mol/L的西地那非和I μ mol/L伐地那非溶液吸附曲線b :1 μ mol/L的西地那非和10 μ mol/L他達(dá)那非溶液吸附曲線c 1 μ mol/L的西地那非溶液吸附曲線。圖中右側(cè)中自下至上依次為c、a、b。
具體實(shí)施方式
藥品和試劑=Al2O3 (O. 05 μ m，上海辰華儀器有限公司)，西地那非、伐地那非、他達(dá)那非(Sildenafil，鄭州荔諾生物科技有限公司)，氯化鉀(KC1)、鐵氰化鉀(K3Fe (CN)6)(分析純，上海新寶精細(xì)化工廠)，無(wú)水乙醇、乙腈(分析純，國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸二氫鈉(NaH2PO4. 2H20 )，磷酸氫二鈉(Na2HPO4. 12H20，南京化學(xué)試劑有限公司)，I，4-對(duì)苯二胺(P-Phenylene diamine, p-PD,梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，氧化還原石墨烯(RG0，自制)硫酸(H2SO4,上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。O. 2mol · L^1Na2HPO4. 12H20 和 O. 3mol · L^1NaH2PO4. 2H20 水溶液配制 pH 5. 8 的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)。聚二烯丙基二甲基氯化銨(Poly diallyldimethyl ammonium chloride, F1DDA,美國(guó) Sigma-aldrich 公司)，聚苯乙烯橫酸鈉(Polysodium-p-styrenesulfonate, PSS,美國(guó) Sigma-aldrich 公司),實(shí)施例中的H)DA-RG0、PSS-RGO采用下述方法制備a) GO :參考文獻(xiàn)[1]，取3. Og膨脹石墨，加入120mL濃硫酸，冰浴攪拌，分3次加入16. Og高錳酸鉀。35 40°C攪拌20小時(shí)后分批次加水250mL，80°C熱水浴攪拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)物逐漸變?yōu)榱咙S色。冷卻后加入40mL過(guò)氧化氫攪拌過(guò)夜，制得GO (氧化石墨烯)。然后經(jīng)酸洗、水洗至pH接近6。超聲分散GOf 2小時(shí)。b) PDDA-RGO :參考文獻(xiàn)[2]，GO定量為0. 5mg/mL，超聲分散Ih。在快速攪拌條件下取200mL GO,加入28%PDDA水溶液2ml，超聲2h，快速攪拌12h，水溶液清洗除去多余TODA。加入乙二醇，調(diào)PH11，在140度條件下反應(yīng)4h以上，清洗，得到roDA-RGO。c) PSS-RGO G0 定量為 0. 5mg/mL,超聲分散 Ih。取 200mL GO 加入 600mg PSS 超聲30min，50°C攪拌24h。冷卻后加入氨水和水合肼各4mL，95 100°C攪拌24h。經(jīng)水洗且超聲分散得到PSS-RG0。實(shí)施例I( I)玻碳電極預(yù)處理玻碳電極(Φ=3ι πι)經(jīng)0. 05 μ m的Al2O3懸池液拋光后,雙蒸水淋洗,然后分別用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗Imin。( 2 )分子層層自組裝修飾電極將修飾電極浸入到含I3DDA的水溶液(0. 5wt%)中，靜電吸附5h后用雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯(PSS-RG0，0. 6mg/mL)溶液中15min，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；然后浸入帶正電的氧化還原石墨烯(PDDA-RG0，0. 6mg/mL)溶液中15min，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；每RG07RG0+為一層，重復(fù)10次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 10GCE電極，即得到10層RGO層層自組裝修飾的玻碳電極(3)分子印記自組裝溶液配制含5mmol *L_1對(duì)苯二胺和lmmol *L_1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合緩沖溶液，充氮?dú)獬鹾竺芊?，室溫避光環(huán)境中保持20h，完成自組裝。(4)電聚合反應(yīng)將分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)池中，避光，通氮?dú)釯Omin后，插入分子印記層自組裝修飾好的電極，于+0. 8電位下，采用計(jì)時(shí)電流法電聚合500s，取出，去離子水淋洗，氮
氣吹干。(5)洗脫模板分子-O. 8V恒電壓下，在O. 6mol I1H2SO4溶液中處理3min，去除模板分子。取出，去離子水反復(fù)淋洗干凈，氮?dú)獯蹈?，即得分子印記膜電化學(xué)傳感器(MIS)。MIS的制備過(guò)程示。

實(shí)施例2( I)玻碳電極預(yù)處理玻碳電極(Φ=3ι πι)經(jīng)O. 05 μ m的Al2O3懸池液拋光后,雙蒸水淋洗,然后分別用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗Imin。( 2 )分子層層自組裝修飾電極將修飾電極浸入到含I3DDA的水溶液(lwt%)中，靜電吸附5h后用雙蒸水沖洗干凈,N2吹干；浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯(PSS-RG0, O. 4mg/mL)溶液中15min,雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；然后浸入帶正電的氧化還原石墨烯(PDDA-RG0，O. 4mg/mL)溶液中15min，，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；每RG07RG0+為一層，重復(fù)20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE電極，得到20層RGO層層自組裝修飾的玻碳電極。(3)分子印記自組裝溶液配制含IOmmol · L—1對(duì)苯二胺和Immol · L—1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合緩沖溶液，充氮?dú)獬鹾竺芊?，室溫避光環(huán)境中保持10h，完成自組裝。(4)電聚合反應(yīng)將分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)池中，避光，通氮?dú)釯Omin后，插入分子印記層自組裝修飾好的電極，于+0. 6電位下，采用計(jì)時(shí)電流法電聚合600s，取出，去離子水淋洗，氮?dú)獯蹈?5)洗脫模板分子-O. 6V恒電壓下，在O. 7mol I1H2SO4溶液中處理4min，去除模板分子。取出，去離子水反復(fù)淋洗干凈，氮?dú)獯蹈?，即得分子印記膜電化學(xué)傳感器(MIS)。實(shí)施例3( I)玻碳電極預(yù)處理玻碳電極(C>=3mm)經(jīng)O. 05 μ m的Al2O3懸池液拋光后,雙蒸水淋洗,然后分別用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗Imin。( 2 )分子層層自組裝修飾電極將修飾電極浸入到含I3DDA的水溶液(3wt%)中，靜電吸附5h后用雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯(PSS-RG0，O. 7mg/mL)溶液中15min，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；然后浸入帶正電的氧化還原石墨烯(PDDA-RG0，O. 7mg/mL)溶液中15min，，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；每RG07RG0+為一層，重復(fù)20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE電極，得到20層RGO層層自組裝修飾的玻碳電極。(3)分子印記自組裝溶液配制含20mmol · L-1對(duì)苯二胺和Immol · L-1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合緩沖溶液，充氮?dú)獬鹾竺芊?，室溫避光環(huán)境中保持8h，完成自組裝。(4)電聚合反應(yīng)
將分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)池中，避光，通氮?dú)釯Omin后,插入分子印記層自組裝修飾好的電極，于+0. 4電位下，采用計(jì)時(shí)電流法電聚合800s，取出，去離子水淋洗，氮
氣吹干。(5)洗脫模板分子-O. 4V恒電位下，在O. 5mol I1H2SO4溶液中處理5min，去除模板分子。取出，去離子水反復(fù)淋洗干凈，氮?dú)獯蹈?，?得分子印記膜電化學(xué)傳感器。實(shí)施例4( I)玻碳電極預(yù)處理玻碳電極(Φ=3ι πι)經(jīng)O. 05 μ m的Al2O3懸池液拋光后,雙蒸水淋洗,然后分別用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗Imin。( 2 )分子層層自組裝修飾電極將修飾電極浸入到含I3DDA的水溶液(2wt%)中，靜電吸附5h后用雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯(PSS-RG0，O. 8mg/mL)溶液中15min，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；然后浸入帶正電的氧化還原石墨烯(PDDA-RG0，O. 8mg/mL)溶液中15min，，雙蒸水沖洗干凈，N2吹干；每RG07RG0+為一層，重復(fù)20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE電極，得到20層RGO層層自組裝修飾的玻碳電極。(3)分子印記自組裝溶液配制含40mmol · L-1對(duì)苯二胺和Immol · L-1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合緩沖溶液，充氮?dú)獬鹾竺芊?，室溫避光環(huán)境中保持6h，完成自組裝。(4)電聚合反應(yīng)將分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)池中，避光，通氮?dú)釯Omin后，插入分子印記層自組裝修飾好的電極，于+1. O電位下，采用計(jì)時(shí)電流法電聚合400s，取出，去離子水淋洗，氮
氣吹干。(5)洗脫模板分子-O. 2V恒電位下，在O. 4mol I1H2SO4溶液中處理6min，去除模板分子。取出，去離子水反復(fù)淋洗干凈，氮?dú)獯蹈桑吹梅肿佑∮浤る娀瘜W(xué)傳感器。MIES制備過(guò)程的表征I.電極修飾過(guò)程的電化學(xué)表征I. I電聚合前不同修飾玻碳電極循環(huán)伏安圖分析對(duì)比兩種方法修飾的玻碳電極電流響應(yīng)值的變化。同一根玻碳電極先后操作(al為裸-GCE的CV曲線、bl石墨烯LBL-GCE的CV曲線、cl電聚合后MIPs的CV曲線、dl洗脫模板分子MIES的CV曲線)，經(jīng)相同的方法預(yù)處理后，按上述CV法在除氧K3Fe (CN) 6/KCl測(cè)試溶液中測(cè)定CV曲線。結(jié)果顯示，bl中電極的CV面積最大，電流響應(yīng)值最高，說(shuō)明石墨烯層層吸附修飾后玻碳電極氧化還原反應(yīng)敏感度最高，即(RG0+/RG0_) 20/PDDA/GCE薄膜表面?zhèn)鬟f電荷的能力更強(qiáng)，可能是由于層層吸附石墨烯電極比表面積更大，表面可自由移動(dòng)電子的數(shù)目多，從而提高了薄膜電荷傳導(dǎo)能力。I. 2MIES制備過(guò)程中各階段循環(huán)伏安對(duì)比按上述CV法，對(duì)MIES制備過(guò)程中各階段進(jìn)行了循環(huán)伏安表征。(圖I結(jié)果顯示，在al、bl中石墨烯層層吸附法修飾的循環(huán)伏安電流響應(yīng)值較高，CV曲線面積較大，表明經(jīng)石墨烯層層吸附法修飾后，玻碳電極的表面?zhèn)鬟f電荷的能力更強(qiáng)，導(dǎo)電能力增強(qiáng)。分析Cl曲線，結(jié)果表明隨著電極表面電聚合的進(jìn)行，MIPs膜逐漸變厚，電極表面形成了一層致密的弱導(dǎo)電性聚苯二胺薄膜，阻礙了探針?lè)肿拥难趸€原反應(yīng)，因此循環(huán)伏安電流響應(yīng)值逐漸降低，說(shuō)明了分子聚合膜能夠穩(wěn)定地修飾在電極表面。從曲線dl中可以看出，將印記膜電極浸入O. 5mol/L H2SO4溶液中用電位誘導(dǎo)法洗脫模板分子后，循環(huán)伏安電流響應(yīng)值顯著增強(qiáng)，說(shuō)明目標(biāo)分子通過(guò)該途徑洗脫后，形成帶有一定數(shù)目印記孔穴的印記膜，探針?lè)肿涌梢酝ㄟ^(guò)孔穴到達(dá)電極表面進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，因此，電流響應(yīng)值增加。I. 3MIES制備過(guò)程中各階段交流阻抗對(duì)比

法拉第阻抗可用來(lái)有效地探測(cè)修飾電極表面的狀況。在交流阻抗曲線中弧的半徑越大，阻抗越大，反之阻抗越小。按上述交流阻抗法在測(cè)試背景溶液中對(duì)裸GCE曲線(a2)、石墨烯LBL-GCE曲線(b2)、電聚合后MIPs曲線(c2)、洗脫模板分子的MIES曲線(d2)進(jìn)行了交流阻抗表征。圖2結(jié)果顯示，在a2、b2中，石墨烯層層吸附法修飾的玻碳電極交流阻抗較小，表明經(jīng)石墨烯層層吸附法修飾后，玻碳電極的電子轉(zhuǎn)移的阻力降低，導(dǎo)電能力增強(qiáng)。分析c2圖，結(jié)果表明隨著電極表面自組裝的進(jìn)行，MIPs膜逐漸變厚，電極阻抗逐漸增大。說(shuō)明通過(guò)自組裝和電聚合，分子聚合膜能夠穩(wěn)定地修飾在電極表面。從d2中可以看出，將印記膜電極浸入O. 5mol/LH2S04溶液中用電位誘導(dǎo)法洗脫模板分子后，阻抗值明顯減小，這說(shuō)明目標(biāo)分子可以通過(guò)該途徑洗脫，印記膜電極可實(shí)現(xiàn)再生。MIES吸附性能評(píng)價(jià)I.動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)分別精密配置5 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L的西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別于I、5、10、15、20、25、30、40min時(shí)取出，按上述CV法測(cè)定西地那非傳感器的電化學(xué)響應(yīng)值得變化。曲線在初始階段上升比較快，約在20min趨于飽和。即使西地那非的初始濃度不同，達(dá)到飽和狀態(tài)吸附量基本相同，可見(jiàn)膜內(nèi)識(shí)別位點(diǎn)數(shù)一定，進(jìn)一步證明了印記層內(nèi)形成了西地那非的特異性孔穴。2.靜態(tài)吸附試驗(yàn)用MIPs對(duì)150 μ L的一系列濃度(O. 5 μ mol/L-250 μ mol/L)西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液分別吸附20min。按上述CV法測(cè)試吸附前后電極電流相應(yīng)變化值，隨著西地那非濃度增大，Δ Ip也逐漸增大，這是由于較多的西地那非可占據(jù)較多的印記孔穴，阻塞探針?lè)肿油ㄟ^(guò)聚合層發(fā)生氧化還原反應(yīng)而使電流減小，電流變化值增大。當(dāng)濃度為50 μ mol -Γ1時(shí)，吸附達(dá)到平衡，Λ Ip值不再變化，認(rèn)為此時(shí)識(shí)別位點(diǎn)幾乎全部被模板分子占據(jù)，表明印記孔穴及活性結(jié)合位點(diǎn)對(duì)西地那非具有高度親合力和特異的識(shí)別能力。3.選擇性吸附試驗(yàn)選擇性是考察分子印記聚合物印記效果和性能好壞的重要指標(biāo)，也是傳感器能否應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)的前提。設(shè)計(jì)干擾性實(shí)驗(yàn)用于考察分子印記效果，即研究膜內(nèi)識(shí)別位點(diǎn)對(duì)模板分子是否具有特異選擇性，是否不受其他競(jìng)爭(zhēng)性底物的干擾。實(shí)驗(yàn)中采用ED類化合物伐地那非和他達(dá)那非進(jìn)行與西地那非進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。分別將電極浸入A、B、C溶液里吸附20min后，在Immol · Γ1鐵氰化鉀和O. Imol · T1KCl的溶液中采用前文中的DPV法進(jìn)行DPV掃描分析。結(jié)果顯示，印記膜電極對(duì)A、B、C的電流響應(yīng)值相近或相同，表明在I倍和10倍濃度干擾物分別存在得條件下，印記膜對(duì)西地那非的吸附量不變，即西地那非洗脫后留下的印記孔穴對(duì)西地那非的吸附不受伐地那非和他達(dá)那非的干擾，從而顯示本實(shí)驗(yàn)中制備的西地那非電化學(xué)傳感器具有穩(wěn)定的特異性吸附能力。A 1 μ mol/L的西地那非和I μ mol/L伐地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液B :1 μ mol/L的西地那非和10 μ mol/L他達(dá)那非標(biāo)準(zhǔn)溶液C :1 μ mol/L的西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品測(cè)定方法學(xué)I.標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限 西地那非的DPV氧化峰電流與其濃度在2. O X 10-8-5· O X 10_7mol · Γ1和5. OX 10_7-5. OX 10_5mol · L—1的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為Ip=-2. 5251C+9. 9314，r=0. 9973。Ip=-O. 0159C+8. 6788，r=0. 9971。由于氧化還原石墨烯納米粒層層修飾而產(chǎn)生了大的比表面積，石墨烯優(yōu)良的電傳導(dǎo)和氧化催化活性，以及MIS具有的選擇富集與吸附特性，使檢測(cè)限(LOD)可達(dá)到2. OXlO^mol · Γ1 (S/N=3)，與已報(bào)道的傳感器相比有更高的靈敏度。2. MIES的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性同實(shí)施例3法制備5根LBL-MIES，測(cè)定10 μ mol · Γ1西地那非PBS溶液吸附前后Δ Ip, RSD 為 4. 7% ;同一根 LBL-MIES 重復(fù)測(cè)定Λ IplO 次，RSD 為 2. 7%。表明 LBL-MIES 制備方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，且測(cè)定重復(fù)性優(yōu)良。另將LBL-MIES干燥后4° C冰箱保存10天，其電流響應(yīng)降為初始時(shí)的94%，20后電流響應(yīng)下降低于10%。3.實(shí)際樣品分析以本實(shí)施例2得到的LBL-MIES測(cè)定片劑中的西地那非，取某補(bǔ)腎強(qiáng)身片(規(guī)格0. 28g/片)5片，用研缽研磨充分,稱取粉末IOOmg,以IOmL乙腈超聲萃取20min。過(guò)濾后取濾液lmL，氮?dú)獯蹈珊蠹尤雙H5. 6的磷酸鹽緩沖液，采用上述中的DPV法測(cè)定樣品中西地那非的濃度，結(jié)果顯示中藥性保健品強(qiáng)身片中的西地那非含量為7. 91 μ g/g。分別在補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中藥保健品中加入低、中、高3個(gè)濃度的西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表I。表I補(bǔ)腎強(qiáng)生片中西地那非的含量測(cè)定
H標(biāo)物樣品含量(Pg/g)加樣量(g/g) 回收率(％) RSD (%)
4. 74 92. 34 2.31西地那非 7.91 9.49 97. 71 2.03___11. 86__95. 86__I. 8權(quán)利要求
1.一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟 a)電極預(yù)處理將玻碳電極拋光后清洗； b)分子層層自組裝修飾電極將預(yù)處理后的電極浸入到含TODA的水溶液中，進(jìn)行靜電吸附后用沖洗干凈并吹干；再將其浸入至帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS-RGO溶液，浸潰后洗凈、吹干；繼續(xù)浸入到帶正電的氧化還原石墨烯TODA-RGO溶液中，浸潰后洗凈、吹干；重復(fù)前述浸入帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS-RGO溶液和帶正電的氧化還原石墨烯I3DDA-RGO溶液的步驟，以每RG07RG0+為一層，重復(fù)浸潰10 20層，得到10 20層RGO的分子層層自組裝修飾電極； c)分子印記自組裝溶液配制含苯二胺類功能單體和西地那非的乙醇/HAC-NaAC緩沖液，將其用氮?dú)獬鹾竺芊猓?0°C 30°C避光環(huán)境中放置5 20h，得到分子印記自組裝溶液；其中，西地那非和苯二胺類功能單體的摩爾濃度比為1:1 1:50 ； d)電聚合反應(yīng)將步驟c)得到的分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)容器中，避光，通氮?dú)夂?，插入步驟b)得到的RGO層層自組裝修飾的玻碳電極，于+0. 2^1. OV電位下，采用計(jì)時(shí)電流電聚合400 800s，取出，淋洗、吹干； e)洗脫模板分子將步驟d)得到的電極浸AH2SO4溶液中，在-0.8^+0. 2V電位下處理3 IOmin0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟a)中，玻碳電極拋光后先依次用乙醇和水超聲清洗，然后用雙蒸水淋洗并用氮?dú)獯蹈伞?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟b)中，處理后的電極浸入到含I3DDA的水溶液中靜電吸附的時(shí)間為4 6h ;靜電吸附后用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?；所述I3DDA的水溶液的質(zhì)量濃度為0. 59T5. 0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟b)中，電極浸入至帶負(fù)電的氧化還原石墨烯PSS-RGO溶液的時(shí)間為l(T60min ;浸潰后用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?；所述PSS-RGO溶液中RGO的摩爾濃度范圍為0. Img/mL 5. 0mg/mLo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟b)中，電極浸入到帶正電的氧化還原石墨烯I3DDA-RGO溶液中的時(shí)間為l(T60min ；浸潰后用雙蒸水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?；所述I3DDA-RGO溶液中RGO的摩爾濃度范圍為0.lmg/mL 5. 0mg/mLo
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟c)中，所述苯二胺類功能單體為鄰苯二胺、對(duì)苯二胺或間苯二胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟c)中，西地那非和苯二胺類功能單體的摩爾濃度比為1:5 1:20。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟c)中，含苯二胺類功能單體和西地那非的乙醇/HAC-NaAC緩沖液中西地那非的濃度范圍為0. lmmol/L 5. 0mmol/L ;苯二胺類功能單體的濃度范圍為5. 0mmol/L 50. 0mmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟d)中，分子印記自組裝溶液倒入反應(yīng)容器后避光通氮?dú)獾臅r(shí)間為l(T30min。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于在步驟e)中，H2SO4溶液的濃度范圍為0. 2mol/L^2. OmoI/L0
全文摘要
本申請(qǐng)公開(kāi)了一種西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器的制備方法，該方法依次經(jīng)過(guò)電極預(yù)處理、分子層層自組裝修飾電極、分子印記層自組裝、電聚合反應(yīng)以及模板分子洗脫等步驟制備得到西地那非分子印記膜電化學(xué)傳感器(MIES)。本發(fā)明制備的分子印記電化學(xué)傳感器具有選擇性高、響應(yīng)快速、靈敏度高、穩(wěn)定性和耐受性良好等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中西地那非的高效、靈敏和實(shí)時(shí)檢測(cè)。它不僅能維護(hù)廣大消費(fèi)者的合法權(quán)益，而且能更好地保障他們的身體健康安全，從而使廣大消費(fèi)者在對(duì)補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中藥保健品、食品的選購(gòu)方面具有更加清晰的認(rèn)識(shí)，這對(duì)完善我國(guó)藥事管理與法規(guī)，規(guī)范藥品生產(chǎn)企業(yè)的行為，凈化中藥保健品市場(chǎng)具有極為重要的推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102768232SQ20121022572
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者周學(xué)敏, 姜慧君, 文婷婷, 李蕓, 薛誠(chéng), 韓青 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)