專利名稱：檢測her2基因表達(dá)水平的實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種PCR試劑盒，尤其是涉及一種檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性第二大常見腫瘤，發(fā)病率僅次于非黑色素瘤皮膚癌，是導(dǎo)致患癌癥婦女死亡的第二大主要原因，其發(fā)病率約占全部女性惡性腫瘤的16%，且它的發(fā)病常與遺傳有關(guān)，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，59TlO%的乳腺癌是家族性的。20 世紀(jì)以來，乳腺癌的發(fā)病率在世界各地均有上升的趨勢，據(jù)資料統(tǒng)計，僅2008年全球乳腺癌死亡人數(shù)就高達(dá)458，503人，占女性惡性腫瘤死亡人數(shù)的 13. 7%(Boyle P，Levin B. World Cancer Report 2008 [M].France :IARC, 2008)。近年來，我國女性乳腺癌的發(fā)病率也正以每年3% 4%的增長率急劇上升，每年約有20余萬婦女患乳腺癌，其中，約209^30%的乳腺癌患者為人類表皮生長因子受體-2 (Her2/neu)陽性乳腺癌。Yang 等(Yang L, Parkin DM, Ferlay J, et al. Estimates of Cancer Incidencein China for 2000and Projections for 2005[J]. Cancer Epidemiol BiomarkersPrev, 2005, 14:243-250)根據(jù)全國腫瘤死亡率監(jiān)測資料預(yù)測，我國女性乳腺癌的發(fā)病率將從2000年的19.9 / 10萬上升到2005年的24. 8 / 10萬。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，我國女性乳腺癌的發(fā)病年齡正趨于年輕化，近四成患者在4(T49歲之間被診斷為乳腺癌，這部分患者可能在治療過程中經(jīng)歷絕經(jīng)過程，這一特點與歐美國家三分之二以上患者發(fā)病時已經(jīng)絕經(jīng)形成鮮明對比，由中國癌癥基金會發(fā)起的中國首個大規(guī)模乳腺癌流行病調(diào)研項目一 “中國乳腺癌流行病學(xué)調(diào)研項目”在2011年發(fā)布的整體調(diào)研結(jié)果顯示，我國女性乳腺癌病人發(fā)病的中位年齡為48歲，比西方提早了 10年，因此乳腺癌的早期診療研究對于我國乃至全球女性生命健康具有非常重要的意義。HER2是原癌基因人類表皮生長因子受體_2 (Human Epidermal Growth FactorReceptor-2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色體17ql2_17q21上，編碼相對分子質(zhì)量為185kDa的跨膜受體樣蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長因子受體，由胞外區(qū)(ECD)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)區(qū)(ID)三部分構(gòu)成，胞外區(qū)主要由2個配體結(jié)合域(RLD)與 2 個富含半胱氨酸區(qū)構(gòu)成(Lohrish C，Piccart M. An overview of HER-2[J]. SeminOncol, 2001, 28:3-11)。1987 年，Slamon 等(Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human BreastCancer:Correlation of Relapse and Survival with Amplification of the HER2/neu oncogene [J], Science, 1987，235 (4785) : 177-182)在對 189 名人乳腺癌患者的研究中，首次報道了 J1ER2基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，指出HER2基因在乳腺癌的生物學(xué)行為和發(fā)病機(jī)制中有重要作用，并認(rèn)為J1ER2基因的擴(kuò)增水平是比雌激素受體、腫瘤大小等更有價值的預(yù)后指標(biāo)。此后，Ross 等(Ross JS, Fletcher JA. The HER-2/neu Oncogene inBreast Cancer-Prognostic Factor, Predictive Factor and Target for Therapy[J].Stem Cells, 1998，16:413-428)對涉及15248例病人的47組試驗進(jìn)行了回顧性研究，結(jié)果顯示，對60%的試驗組和67%的病人來說，HER2基因的擴(kuò)增水平可以作為判斷乳腺癌預(yù)后的獨立指標(biāo)。Schmidt 等(Schmidt M, Lewark B，Kohlschmidt N，et al. Long-termPrognostic Significance of HER-2/neu in Untreated Node-negative Breast CancerDepends on the Method of Testing [J]. Breast Cancer Res, 2005，7:256-266)通過對未經(jīng)任何治療的淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者HER2狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增比Her2蛋白表達(dá)對于預(yù)后的意義更加明確，因此，他們認(rèn)為HER2基因擴(kuò)增可作為一個獨立的預(yù)后因子。Mrhalova 等(MrhalovdM, KodetR, KalinovdM,et al. Relative Quantification of ERBB2mRNA in Invasive Duct Carcinoma of the Breast: Correlation with ERBB—2 ProteinExpression and ERBB2 Gene Copy Number[J]. Pathol Res Pract, 2003, 199(7):453-461)通過對39例浸潤性導(dǎo)管癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HER2基因mRNA的表達(dá)水平(熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法Q-RT-PCR)與HER2蛋白表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)法，IHC)及HER2基因拷貝數(shù)水平(熒光原位雜交法，F(xiàn)ISH)存在較好的一致性，且在可疑病例的判斷中有較出色的表現(xiàn)。Celine Bossard 等(Bossard C，Bieche I, Doussal VL, et al. Real-time RT-PCR:AComplementary Method to Detect HER-2 Status in Breast Carcinoma[J]. Anticancer Res, 2005, 25:4679-4684)也通過44例浸潤性乳腺癌的研究證實了 Mrhalova等的研究，并對不相符病例產(chǎn)生的原因進(jìn)行了闡述。2007年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)發(fā)布HER2基因作為乳腺癌治療指標(biāo)的更新建議，其中指出，對每一例原發(fā)浸潤性乳腺癌的診斷，以及復(fù)發(fā)病人選擇曲妥珠單抗治療前都應(yīng)進(jìn)行 HER2 基因表達(dá)水平的評估檢測(Harris L, Fritsche H，Mennel R, et al. AmericanSociety of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendations for the Use ofTumor Markers in Breast Cancer[J]. J Clin Oncol, 2007, 25 (33) :5287-5312)。乳腺腫瘤患者ffiR2陽性意味著乳腺腫瘤細(xì)胞表面的HER2蛋白數(shù)量增多，過度傳遞信號，刺激癌細(xì)胞瘋狂增殖，HER2陽性的患者同其他乳腺癌病人相比，腫瘤惡性程度更高，進(jìn)展更快，更容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且此類病人通常對內(nèi)分泌治療(他莫昔芬)不敏感，預(yù)后較差(Salvadori B，Pinzani P, Distante V, et al. Comparison of Pre-and Post SurgicalConcentrations of Blood HER-2 mRNA and HER-2Extracellular Domain Reflects HER-2Status in Early Breast Cancer [J]. Clin Chem, 2005，51 (I) : 254-256)。1998 年被美國FDA批準(zhǔn)上市，2002年在中國上市的生物靶向治療藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab )商品名赫賽汀(Here印tin)，是人類歷史上第一個生物基因靶向治療藥物，作為癌癥治療史上的重要突破，赫賽汀的出現(xiàn)將乳腺癌的治療引入了生物基因靶向治療的新時代。赫賽汀(曲妥珠單抗)是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于HER2的細(xì)胞外部位，該藥能夠靶向作用于HER2受體，主要用于HER2過表達(dá)的乳腺癌患者，研究報道指出，HER2陽性的乳癌患者在化療時加用曲妥珠單抗，可降低乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險和病死率，延長患者的生存期(Slamon D, Eiermann ff, Robert N，et al. Adjuvant Trastuzumab inHER2-Positive Breast Cancer [J], N Engl J Med, 2011，365:1273-1283)。目前醫(yī)學(xué)界已經(jīng)達(dá)成共識，曲妥珠單抗是HER2陽性乳腺癌的一種有效治療手段(Shak S. Overview ofthe Trastuzumab(Herceptin)Anti-HER2 Monoclonal Antibody Clinical Program inHER2-overexpressing Metastatic Breast Cancer[J]. Semin Oncol, 1999，26(4):71-77)。因此，準(zhǔn)確的HER2檢測對于乳腺癌靶向治療患者的篩選起決定性作用。目前，F(xiàn)DA認(rèn)可的篩選HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者的方法有免疫組織化學(xué)(IHC)法和突光原位雜交(Fluorescence in Situ Hybridization, FISH)法,一般采用免疫組織化學(xué)法檢測HER2受體蛋白過度表達(dá)，應(yīng)用熒光原位雜交法檢測HER2基因的擴(kuò)增水平(Kroese M, Zimmern RL, Pinder SE. HER2 Status in Breast Cancer-an Example ofPharmacogenetic Testing[J]. J R Soc Med. 2007,100:326-329)。免疫組織化學(xué)法檢測HER2蛋白表達(dá)是目前最為常用的方法，它是用帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)，IHC法因其操作簡便、價格低廉、判讀方便、便于保存等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷，但由于其檢測過程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，且結(jié)果易受組織處理、不同抗體的敏感性差異、觀察者主觀判斷的不同以及17號染色體多體的干擾的影響，常造成其檢測結(jié)果的差異。
比較而言，熒光原位雜交法通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，利用熒光檢測體系對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析，其檢測冷凍組織或福爾馬林固定、石蠟包埋組織的J1ER2基因擴(kuò)增的穩(wěn)定性較好，不易受組織處理等影響，且應(yīng)用不同顏色的熒光信號同時標(biāo)記J1ER2基因和17號染色體著絲粒，消除了 17號染色體多體的干擾，然而FISH也存在檢測費用昂貴、熒光淬滅致結(jié)果無法長期保存、操作難度大，時間長、并且不利于病理醫(yī)生在暗視野下觀察組織細(xì)胞形態(tài)等缺點，從而導(dǎo)致HER2假陽性或假陰性的誤判等缺陷。繼而發(fā)展的實時熒光定量PCR是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段，能在短時間內(nèi)獲得數(shù)百萬個特異產(chǎn)物的技術(shù)，并能實時監(jiān)控，閉管檢測，具有快速簡便、靈敏度高和無交叉污染等優(yōu)點。依據(jù)其原理發(fā)明的實時定量RT-PCR，已被認(rèn)為是定量檢測mRNA的金標(biāo)準(zhǔn)方法。本發(fā)明以專利技術(shù)一環(huán)狀引物(阮力，何東華，鄭立謀，陳琰.一種用于核酸擴(kuò)增的環(huán)形引物及其應(yīng)用.中國專利CN 101671674A)為引物，建立一種應(yīng)用于HER 2 mRNA定量檢測的方法。環(huán)狀引物由于存在的自身反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，只有當(dāng)靶序列與引物靶序列結(jié)合區(qū)的結(jié)合力大于反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)合的能量，引物才可以與靶序列發(fā)生雜交，并獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。因此環(huán)狀引物較之普通的直線引物具有一定的技術(shù)方法優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種既快速、準(zhǔn)確，又經(jīng)濟(jì)、價廉，并且易于標(biāo)準(zhǔn)化的HER2基因表達(dá)水平的檢測方法。所述檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒包括HER2基因PCR反應(yīng)液、ACTB基因PCR反應(yīng)液、Taq酶系、對照品和包裝物；所述HER2基因PCR反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、HER2基因特異性上游引物、HER2基因特異性下游引物和EVA Green熒光染料組成，所述ACTB基因PCR反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、ACTB基因特異性上游引物、ACTB基因特異性下游引物和EVA Green熒光染料組成；所述HER2基因特異性上游引物F序列為5’ -GTCCGTCCTACAACTACCTTTCTACGGAC-3 ；
所述HER2基因特異性下游引物R序列為5， -TGAGAAGGGCTTGCTGCACTTCTCA-3，；所述ACTB基因特異性上游引物F序列為5， -CAGGATTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3，；所述ACTB基因特異性下游引物R序列為5， -CGCCAACAGACAGC ACTGTGTTGGCG-3 ；其中，引物5’端和3’端帶有下劃線的堿基為參與形成引物內(nèi)雙鏈結(jié)合區(qū)的堿基。所述PCR 反應(yīng)緩沖液由 IOOmM Tris-HCL (pH8. 8)、50mM KCLUOmM MgSO4,50mM (NH4) 2S04 和 25mM dNTPs 組成。所述HER2基因特異性上游弓丨物的濃度、HER2基因特異性下游弓丨物的濃度、ACTB基因特異性上游引物的濃度和ACTB基因特異性下游引物的濃度可均為50 u M0所述Taq酶系可采用熱啟動Taq酶，每反應(yīng)用量可為1U。所述對照品可采用MCF-7細(xì)胞株cDNA和無模板對照品(NTC)等。所述包裝物可采用瓶或管等。當(dāng)所述檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行待測樣本檢測時，只有當(dāng)對照品J1ER2基因和ACTB基因檢測呈陽性，無模板對照品HER2基因和ACTB基因檢測無信號時，待檢測樣本的檢測結(jié)果才有效。PCR的擴(kuò)增程序為第一階段95°C 5min I個循環(huán)；第二階段95°C 10s,63°C15s，72°C 15s，5個循環(huán)；第三階段95°C 10s，60°C 15s，72°C 15s，35個循環(huán)；信號收集第二階段72°C時收集FAM。其中第二階段用于富集特異產(chǎn)物，第三階段用于擴(kuò)增。本發(fā)明的優(yōu)點是(1)設(shè)計了 5’端修飾了的HER2基因和ACTB內(nèi)參基因引物，避免了引物二聚體的形成；(2)運用染料法實時熒光定量RT-PCR的檢測方法，大大降低了試劑盒的成本，減輕了病患的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；(3)檢測速度快，整個檢測過程只需要90min。


圖I為顯示5’端修飾的特異性引物的PCR擴(kuò)增原理。圖2為HER2基因103、104、105、IO6Copise/ii L的4個標(biāo)準(zhǔn)品模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為濃度的對數(shù)Log copies/UL，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct值(dRn) ；y=3. 410x+29. 79 R2=O. 998，-Eff = 96. 5%。圖3為ACTB基因103、104、105、IO6Copise/ii L的4個標(biāo)準(zhǔn)品模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為濃度的對數(shù)Log copies/UL，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct值(dRn) ；y=3. 468x+31. 40R2=0. 995，-Eff = 94. 2%。圖4為顯示PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序。在圖4中，縱坐標(biāo)為溫度Temperature (V)。圖5為無模板對照品中HER2基因(三角形曲線)和ACTB基因(平滑曲線)的擴(kuò)增曲線圖。在圖5中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值Fluorescence (dRn);曲線 a 為 HER2,曲線 b 為 ACTB。圖6為對照品中HER2基因(三角形曲線)和ACTB基因(平滑曲線)的擴(kuò)增曲線圖。在圖6中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn);曲線a為HER2，曲線b為ACTB。
由圖5和6可見，無擴(kuò)增信號，處于基線，說明體系沒有受到污染；對照品的HER2基因(三角形曲線)和ACTB基因(平滑曲線)擴(kuò)增曲線，曲線呈S型，說明體系可有效地檢測HER2基因的擴(kuò)增。圖7為陰性樣本IIHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖7中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值Fluorescence (dRn);曲線a為HER2，曲線b為ACTB0圖8為陰性樣本2IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖8中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值Fluorescence (dRn);曲線a為HER2，曲線b為ACTB0圖9為陰性樣本3IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性的樣本擴(kuò)增曲線圖 。在圖9中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值Fluorescence (dRn);曲線a為HER2，曲線b為ACTB。圖10為陰性樣本4IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖10中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn)；曲線a為HER2,曲線 b 為 ACTB0圖11為陽性樣本IIHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖11中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn)；曲線a為HER2,曲線 b 為 ACTB0圖12為陽性樣本2IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖12中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn)；曲線a為HER2,曲線 b 為 ACTB0圖13為陽性樣本3IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖13中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn);曲線a為HER2,曲線 b 為 ACTB0圖14為陽性樣本4IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本擴(kuò)增曲線圖。在圖14中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles,縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的突光值Fluorescence (dRn)；曲線a為HER2,曲線 b 為 ACTB0在圖11 14中，擴(kuò)增曲線呈S型，定量后F分別為3. 03、5. 93、2. 34、4. 50，說明4例陽性樣本中HER2基因基因存在擴(kuò)增。圖15為顯示5例經(jīng)過IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本應(yīng)用HER2基因表達(dá)水平檢測試劑盒檢測的擴(kuò)增曲線。圖16為顯示5例經(jīng)過IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性的樣本應(yīng)用北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司人Her2/neU基因(Her2)核酸檢測試劑盒檢測的擴(kuò)增曲線。在圖15和16中，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)Cycles，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值Fluorescence (dRn);擴(kuò)增曲線呈S型，說明體系均可有效地檢測HER2基因的表達(dá)，且檢測Ct 值分別為 18. 52,19. 69,20. 81,20. 82,21. 13 和 18. 54,19. 53,20. 65,20. 79,21. 08，說明本試劑盒檢測HER2基因表達(dá)水平的專一性良好。
具體實施方式
下列實施例旨在舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本發(fā)明在對Genebank中已知的人類HER2基因、ACTB基因的基因組序列和mRNA序列進(jìn)行比對分析，選擇HER2基因、ACTB基因的特異性保守區(qū)域設(shè)計了特異性引物，并在引物的5’端自行設(shè)計了 3 8個可以與3’端互補(bǔ)配對堿基修飾，使得一般情況下引物呈環(huán)狀而非普通的線性，只有在高溫變性時引物才會打開與靶序列特異性結(jié)合，從而避免了引物二聚體形成(圖I)。這些引物在熱啟動Taq聚合酶、高純度的脫氧核苷酸(dNTPs)、EVAGreen熒光染料以及Mg2+離子等的PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR擴(kuò)增儀實現(xiàn)核酸擴(kuò)增，根據(jù)2_AAGt值法計算HER2基因的表達(dá)差異，從而達(dá)到快速快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、價廉的檢測HER2基因表達(dá)水平。所述檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒在擴(kuò)增待檢樣本時，需同時檢測對照品(MCF-7細(xì)胞株cDNA)和無模板對照品(NTC)，通過計算2_AAct值對待檢樣本和對照品的HER2基因和ACTB基因表達(dá)進(jìn)行定量，然后通過公式A Ct (待檢樣本)=待檢樣本HER2基因Ct一待檢樣本ACTB基因Ct，A Ct (對照品)=對照品HER2基因Ct一對照品ACTB基因Ct，A A Ct= A Ct (待檢樣本)一 A Ct (對照品)，目的基因的相對總量為2_AAet。 使用2_AA ct定量需要HER2基因和ACTB基因的擴(kuò)增效率一致，取103、104、105、IO6Copise/y L的4個10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，分別檢測HER2基因和ACTB基因的Ct值，兩個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率小于0. I具有可比性，可用2_AAet (圖2和3)。F=2-Act(待■本對照品\ I < 2，表示乳腺癌組織中HER2基因無過表達(dá)；2芻F< 4，表示乳腺癌組織中HER2基因有過表達(dá)；F ^ 4，表示乳腺癌組織中HER2基因存在明顯過表達(dá)。實施例1HER2基因表達(dá)水平檢測試劑盒及其使用I制備包括下列組成成分的試劑盒HER2基因PCR反應(yīng)液(1200 U L)1管、ACTB基因PCR反應(yīng)液(1200 ii L) I管、Taq酶系(30ii L) I管、對照品(300 ii L) I管。2樣本的采集、保存和運輸2. I使用樣本類型新鮮組織、冷凍組織。2. 2樣本采集手術(shù)后將腫瘤組織立即放入液氮冷凍并保存于_80°C。2. 3樣本的保存和運輸新鮮組織、冷凍組織保存在_80°C，保存期為2年。樣本長途運送采用干冰。3、核酸抽提建議使用Invitrogen Trizol RNA提取試劑盒。按照說明書進(jìn)行操作，最后用30 u L DEPC水溶解，之后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。4、逆轉(zhuǎn)錄建議使用QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription 試劑盒。按照說明書進(jìn)行操作。5、實時熒光定量PCR檢測5. I試劑準(zhǔn)備按比例吸取相應(yīng)量的HER2基因PCR反應(yīng)液、ACTB基因PCR反應(yīng)液、Taq酶系(HER2基因PCR反應(yīng)液和ACTB基因PCR反應(yīng)液各19. 8 ii L/人份+Taq酶系0. 2 ii L/人份)，充分混勻后按20 u L/人份分裝入PCR反應(yīng)管，備用。5. 2加樣分別向HER2基因PCR反應(yīng)管和對應(yīng)的ACTB基因PCR反應(yīng)管加入5 ii L逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本，同時向HER2基因PCR反應(yīng)管和對應(yīng)的ACTB基因PCR反應(yīng)管加入5uL對照品樣本作為對照品，向HER2基因PCR反應(yīng)管和對應(yīng)的ACTB基因PCR反應(yīng)管加入
5UL雙蒸水作為NTC。5. 3 編輯(Stratagene Mx3005P)打開EVA Green熒光染料實驗類型，在Plate Setup窗口根據(jù)樣本放入位置在窗口中選擇相應(yīng)的樣本孔并對定義其內(nèi)容，選擇需要采集的信號類型(EVA Green選擇FAM)，在Thermal Profile Setup窗口編輯反應(yīng)程序第一階段95°C 5min I個循環(huán)；第二階段950C 10s，63°C 15s，72°C 15s，5 個循環(huán)；第三階段 95°C 10s,60°C 15s，72°C 15s，35 個循環(huán)；信號收集第三階段72°C時收集FAM (圖4)。所有設(shè)置完成后保存文件，運行。5. 4結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后打開Analysis窗口，選擇樣本孔,點擊Results自動分析結(jié)果。實施例2應(yīng)用HER2基因表達(dá)水平檢測試劑盒檢測8例臨床樣本選取4例經(jīng)過IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性，4例經(jīng)過IHC檢測為HER2基因表達(dá)陽性乳腺癌組織樣本，提取RNA后立即逆轉(zhuǎn)錄，將得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行檢測，同時檢測對照品、NTC。檢測結(jié)果解釋HER2基因(三角形曲線)和ACTB基因(平滑曲線)的無模板對照品無擴(kuò)增信號，處于基線，說明體系沒有受到污染；對照品J1ER2基因(三角形曲線)和ACTB基因(平滑曲線)曲線呈S型，說明體系可有效地檢測HER2基因的表達(dá)(圖5和6)。4例經(jīng)過IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陰性的樣本擴(kuò)增曲線呈S型，定量后F值分別為I. 50、I. 23、I. 75、I. 09，說明4例陰性樣本中HER2基因無過表達(dá)(圖7 10)。4例經(jīng)過IHC檢測為HER2基因表達(dá)陽性的樣本擴(kuò)增曲線呈S型，定量后F值分別為3. 03,5. 93,2. 34、
4.50，說明4例陽性樣本中HER2基因基因存在過表達(dá)(圖11 14)。本次實驗中8例樣本的檢測結(jié)果與IHC的檢測結(jié)果完全吻合，說明利用本試劑盒來檢測乳腺癌患者中J1ER2基因表達(dá)水平是可行的，本試劑盒快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、價廉為臨床檢驗帶來便利的同時也能有效地減低病患的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。實施例3應(yīng)用HER2基因表達(dá)水平檢測試劑盒與北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司人Her2/neu基因(Her2)核酸檢測試劑盒同時檢測5例臨床樣本選取5例經(jīng)過IHC鑒定為HER2基因表達(dá)陽性乳腺癌組織樣本，提取RNA后立即逆轉(zhuǎn)錄，將得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果解釋兩試劑盒的HER2基因擴(kuò)增曲線呈均S型，說明體系均可有效地檢測HER2基因的表達(dá)，且應(yīng)用HER2基因表達(dá)水平檢測試劑盒應(yīng)用HER2基因(三角形曲線)的Ct值分別為18. 52、19. 69,20. 81,20. 82,21. 13，應(yīng)用北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司人Her2/neu基因(Her2)核酸檢測試劑盒應(yīng)用HER2基因(平滑曲線)的Ct值分別為18. 54、19. 53,20. 65,20. 79,21.08 (圖15和16)，說明本試劑盒檢測HER2基因表達(dá)水平的專一性良好。
權(quán)利要求
1.檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括HER2基因PCR反應(yīng)液、ACTB基因PCR反應(yīng)液、Taq酶系、對照品和包裝物； 所述HER2基因PCR反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、HER2基因特異性上游引物、HER2基因特異性下游引物和EVA Green熒光染料組成； 所述ACTB基因PCR反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、ACTB基因特異性上游引物、ACTB基因特異性下游引物和EVA Green熒光染料組成； 所述HER2基因特異性上游引物F序列為5’ -GTCCGTCCTACAACTACCTTTCTACGGAC-3 ； 所述HER2基因特異性下游引物R序列為5， -TGAGAAGGGCTTGCTGCACTTCTCA-3，； 所述ACTB基因特異性上游引物F序列為5， -CAGGATTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3，； 所述ACTB基因特異性下游引物R序列為5， -CGCCAACAGACAGC ACTGTGTTGGCG-3 ； 其中，引物5’端和3’端帶有下劃線的堿基為參與形成引物內(nèi)雙鏈結(jié)合區(qū)的堿基；所述 PCR 反應(yīng)緩沖液由 IOOmM Tris-HCL、50mM KCLUOmM MgS04、50mM(NH4)2S04 和 25mMdNTPs組成。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述HER2基因特異性上游引物的濃度、HER2基因特異性下游引物的濃度、ACTB基因特異性上游引物的濃度和ACTB基因特異性下游引物的濃度均為50 u M0
3.如權(quán)利要求I所述的檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述Taq酶系采用熱啟動Taq酶，每反應(yīng)用量為IU。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述對照品采用MCF-7細(xì)胞株cDNA和無模板對照品。
5.如權(quán)利要求I所述的檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述包裝物采用瓶或管。
全文摘要
檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒，涉及一種PCR試劑盒。所述檢測HER2基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR試劑盒包括HER2基因PCR反應(yīng)液、ACTB基因PCR反應(yīng)液、Taq酶系、對照品和包裝物；采用的引物為環(huán)狀引物，在5’端存在3-8個自行設(shè)計的堿基，在合適條件下可以和3’端序列相互結(jié)合為雙鏈，可有效地避免了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物尤其是引物二聚體形成，并增加其專一性。利用相對定量實時RT-PCR的方法來檢測乳腺癌患者中HER2基因表達(dá)水平，采用2-△△Ct值法對檢測結(jié)果進(jìn)行定量，可用于乳腺癌的早期及轉(zhuǎn)移的診斷，輔助臨床用藥的選擇和預(yù)后判斷等多個領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/64GK102719547SQ201210227940
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者張換敬, 曾驥孟, 李怡, 鄭立謀 申請人:廈門大學(xué)