專利名稱：一種梅花染色體的熒光原位雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及梅花染色體的熒光原位雜交方法。
背景技術(shù)：
突光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization)是 20 世紀(jì) 80 年代末發(fā)展起來的一種重要原位雜交方法，以非放射性熒光標(biāo)記取代放射性同位素標(biāo)記而形成的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。目前，它是構(gòu)建細(xì)胞遺傳圖譜最直接的 方法之一，是研究DNA序列在染色體具體位置的最直接的方法，成為研究特定DNA序列與染色體區(qū)域相關(guān)聯(lián)的有效手段。該技術(shù)在許多科學(xué)研究領(lǐng)域都得到非常廣泛的應(yīng)用，如DNA物理圖誘、染色體圖譜、細(xì)胞遺傳圖譜的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞學(xué)鑒定、外源染色體片段的檢測、基因組結(jié)構(gòu)的研究、物種間親緣關(guān)系的鑒定。梅花(Prunus mume)是我國重要的木本花丼,對梅花染色體研究是進(jìn)行基因定位、構(gòu)建物理圖譜的重要前提，為進(jìn)一步選育優(yōu)良品種、研究品種親緣關(guān)系、并為梅品種國際登錄和新品種保護(hù)提供分子水平品種鑒定技術(shù)。目前，關(guān)于梅花染色體的報道較少，僅限于利用壓片法或涂片法進(jìn)行鏡檢觀察，根據(jù)染色體長短、大小以及長短臂進(jìn)行核型分析?！睹坊―NA指紋圖譜的建立與研究》(明軍，2002，北京林業(yè)大學(xué))是通過AFLP銀染反應(yīng)體系對DNA進(jìn)行分析，直觀表現(xiàn)品種間的相似程度，但其多態(tài)性條帶率與鑒別效率的相關(guān)性較低。由于梅花屬于小染色體植物(野生種與栽培梅染色體數(shù)目及形態(tài)研究，包滿珠，1995)，且染色體形態(tài)相似程度高，難以進(jìn)行有效的核型分析。傳統(tǒng)的核型分析方法有其自身的局限性，對于染色體小、形態(tài)相似的植物，其精確性有待提聞。因此，需要提聞雜交的特異性和效率，以獲得良好的效果。不僅這樣，在FISH實(shí)驗(yàn)過程中，由于固定方法或洗脫不完全，很容易導(dǎo)致非特異性雜交，產(chǎn)生假陽性；變性溫度和時間也是一個重要的影響因素，時間過短、溫度過低會造成雜交不完全，時間過長、溫度過高會使染色體斷裂丟失，造成雜交效率降低。因此，需要對FISH技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其很好地應(yīng)用于梅花等小染色體植物。FISH技術(shù)在人類、動物以及少數(shù)植物中已成功運(yùn)用，迄今為止，關(guān)于FISH技術(shù)在梅花中的應(yīng)用未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測梅花染色體的熒光原位雜交方法以應(yīng)用于梅花染色體核型分析。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案以梅花中期染色體作為靶DNA，以玉米45SrDNA為探針進(jìn)行梅花染色體熒光原位雜交。具體地，包括以下步驟I)染色體玻片標(biāo)本的制備與預(yù)處理；2)探針標(biāo)記與探針變性；
3)探針與染色體共變性；4)雜交與雜交后洗脫；5)信號檢測。其中，步驟I)中所述染色體玻片標(biāo)本的制備為以梅花莖尖為材料，采用去壁低滲火焰干燥法制備。其中，步驟I)中所述預(yù)處理為將所述染色體玻片標(biāo)本干燥，RNaseA、胃蛋白酶K處理，乙醇脫水。其中，步驟2)中所述探針標(biāo)記為將30-50ng/ μ I玉米45SrDNA質(zhì)粒1_3份、DIG-Nick translation mix 或Biotin-Nick translation mix 4份和 ddH20 13-15份混合，10-15°C避光反應(yīng)60-90min，加入EDTA I份，得探針標(biāo)記混合液?！?yōu)選地，玉米45SrDNA質(zhì)粒為3份，ddH20為13份。其中，步驟2)中所述探針變性為將所述探針標(biāo)記混合液1-4份和10mg/ml鮭魚精溶液4份按體積比混合，60-65°C烘烤；加入50%去離子甲酰胺10份、20 X SSC溶液2份、50%DS溶液4份，95°C避光變性lOmin，得變性探針。優(yōu)選地，探針標(biāo)記混合液為2份。其中，步驟3)中所述探針與染色體共變性為將變性后的探針加到染色體玻片標(biāo)本上，共變性，變性溫度85°C，變性時間2-4min。 優(yōu)選地，變性時間為3min。其中，步驟4)中所述雜交為將所述共變性后的探針與色體玻片標(biāo)本于37°C黑暗培養(yǎng) 18-24h。雜交液的成分按體積百含量為50%的去離子甲酰胺，20%的50%DS溶液，20%的10mg/ml鮭魚精溶液和探針混合液，10%的20 X SSC溶液。其中，步驟4)中所述雜交后洗脫為將雜交后的玻片依次放入2XSSC溶液，洗2X5min ;放入 2 X SSC 溶液，42°C恒溫 IOmin ;放入 IXPBS 溶液，洗 5min。其中，步驟5)中所述信號檢測為加2mg/ml DAPI熒光染液于玻片上，染色5_8min，進(jìn)行檢測。優(yōu)選地，染色時間為5min。本發(fā)明的有益效果I)本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，對共變性方法進(jìn)行改進(jìn)，采用探針變性、染色體和探針共變性兩步來完成變性過程，大大提高雜交成功率。2)本發(fā)明清楚顯示了梅花染色體，雜交特異性高，確定了合適的變性溫度和變性時間，雜交時間和洗脫方法，使得FISH技術(shù)很好的應(yīng)用于梅花等小染色體植物的染色體檢測。3)本發(fā)明通過觀察玉米45SrDNA在梅花染色體中的分布，區(qū)分同源及非同源染色體，輔助梅花核型分析，有利于其他基因在染色體上的物理定位，為梅花染色體深入研究，物理圖譜的構(gòu)建，梅花品種的分子鑒別及育種提供了新的途徑和方法。


圖I為玉米45SrDNA在梅花‘龍游’中信號位點(diǎn)分布圖像；
圖2為梅花‘龍游，中期分裂相圖像；圖3為梅花‘龍游’中期分裂相的熒光原位雜交效果圖像；圖4為梅花‘龍游’染色體核型圖；圖5為玉米45SrDNA在梅花‘小宮粉’中信號位點(diǎn)分布圖像；圖6為梅花‘小宮粉’中期分裂相圖像；圖7為梅花‘小宮粉’中期分裂相的熒光原位雜交效果圖像；圖8為梅花‘小宮粉’染色體核型圖。
具體實(shí)施方式
·以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用試劑20XSSC 溶液(檸檬酸鈉緩沖液):175. 3g NaCl,88. 2gNa2C6H507 · 2H20 和 1000mlddH20的混合液；10XPBS 溶液是指(磷酸緩沖液):80gNaCl、32. 3gNa2HP04 · 12Η20、4· 5gNaH2P04 ·2Η20和 1000ml ddH20 Ph=7. 4 的混合液。2 X SSC溶液ddH20與20 X SSC溶液體積比為9:1的混合液；4 X SSC溶液ddH20與20 X SSC溶液體積比為4:1的混合液；I X PBS溶液ddH20與10 X PBS溶液體積比為9:1的混合液；10mg/ml鮭魚精溶液將IOmg鮭魚精粉末溶于Iml蒸懼水，沸水溶解5min后分裝-20°C保存；50%DS溶液0. 5g硫酸葡聚糖粉末溶于Iml水中，68°C水浴溶解3h后，分裝_20°C保存；2 μ g/ml Anti-Dig-Rhodamine 溶液將 200 μ g Anti-Dig-Rhodamine 粉末溶于ImlddH2O中，4 °C保存。使用時，使用5%BSA溶液進(jìn)行稀釋，S卩I μ 1200 μ g/mlAnti-Dig-Rhodamine 溶于 99 μ 15%BSA 溶液；5%BSA溶液5g小牛血清蛋白粉末，溶于100ml4XSSC溶液；DAPI熒光染液2mgDAPI粉末溶于Iml ddH20,分裝后4°C避光保存。O. lmg/ml胃蛋白酶K溶液將IOmg粉末溶于ImlddH2O配成原液，使用時將原液與ddH20按照1:99的配比進(jìn)行稀釋使用。O. lmg/ml RNaseA溶液將IOmg粉末溶于ImlddH2O配成原液，使用時將原液與ddH20按照1:99的配比進(jìn)行稀釋使用。DIG-Nick translation mix、Biotin-Nick translation mix 購自 Roche,Germany。供試材料栽培品種梅花‘龍游’ ‘小宮粉’購自北京鷲峰森林公園。供試質(zhì)粒玉米45SrDNA探針質(zhì)粒購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米改良中心。實(shí)施例II、染色體玻片標(biāo)本的制備以梅花‘龍游’(Prunus mume ‘Longyou’)春季萌發(fā)的莖尖為材料，其長度為0. 5-lcm為宜。利用去壁低滲火焰干燥法制備染色體玻片標(biāo)本，依次進(jìn)行卡諾固定液_20°C固定24h以上、0.075mol/L KCl溶液前低滲處理30min、2. 5%纖維素酶和果膠酶的酶解IlOmiruddH2O后低滲處理30min。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，選擇圖像清晰、分散程度高的中期分裂相標(biāo)本放在_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、染色體玻片標(biāo)本的預(yù)處理I)每4個載玻片一組進(jìn)行操作,將染色體玻片標(biāo)本置于65°C烘箱干燥I小時,力口100 μ 10. lmg/ml RNaseA溶液于染色體玻片標(biāo)本上，用封口膜蓋上載玻片，放入底部有水的濕盒中37°C I小時；2)揭掉封口膜，將染色體玻片放入裝有2XSSC溶液的染色缸中，染缸置于搖床，IOOrpm搖洗2 X 5min后，取出；無需晾干,加20 μ 10. lmg/ml胃蛋白酶K溶液于染色體玻片標(biāo)本上，用封口膜蓋上載玻片，放入底部有水的濕盒中37°C IOmin ；·3)揭掉封口膜，將染色體玻片放入裝有IXPBS溶液的染色缸中，染缸置于搖床，IOOrpm搖洗2 X 5min后，取出；4)依次70%，95%，100%酒精溶液脫水3min，空氣干燥。3、探針標(biāo)記與探針變性I)玉米45SrDNA質(zhì)粒采用堿裂解法試劑盒(購自Biomiga)提取,質(zhì)粒濃度42. 2ng/μ I。以玉米45SrDNA為探針,DIG-Nick translation mix為標(biāo)記物,用德國羅氏公司生產(chǎn)的地高辛缺口轉(zhuǎn)移試劑盒標(biāo)記(Roche,Germany)。20 μ I探針標(biāo)記混合液將玉米45SrDNA探針 3 μ I,DIG-Nick translation mix 4 μ I,加 ddH20 至終體積 20 μ 1,15°C避光反應(yīng) 90min,
Iμ I 50mM EDTA (購自 Fermentas)終止反應(yīng)。2)按照每張染色體玻片加入2 μ I探針的量配制雜交液。標(biāo)記探針雜交液20 μ I :取2 μ I探針標(biāo)記混合液于離心管，加入4 μ I 10mg/ml鮭魚精溶液，放于65°C烘箱開蓋烘烤至4μ I ;加去離子甲酰胺10μ 1、20XSSC溶液2μ 1、50%DS溶液4 μ 1，短暫離心，恒溫干浴器95°C避光變性雜交液lOmin。取出后迅速置于冰上冷卻。4、共變性與雜交I)每張染色體玻片加20 μ I雜交液，蓋上蓋玻片。2) 85°C烘箱共變性3min，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)20h。5、雜交后洗脫I)雜交后的玻片放入裝有2XSSC溶液的染色缸中，染缸置于搖床，IOOrpm搖洗2X5min ;轉(zhuǎn)入裝有2 X SSC溶液的染色缸中，染缸置于42°C恒溫水浴鍋中IOmin ;然后轉(zhuǎn)入裝有I XPBS溶液的染缸中，染缸置于搖床，IOOrpm搖洗5min。2)無需晾干,加100 μ I 2 μ g/ml Anti-Dig-Rhodamine溶液于玻片上,用封口膜蓋上載玻片，放入底部有水的濕盒中37°C I小時。3)揭掉封口膜，將染色體玻片放入裝有IXPBS溶液的染色缸中，染缸置于搖床，IOOrpm搖洗2X5min ;轉(zhuǎn)入無菌水染缸中，IOOrpm搖洗2 X 2min，空氣干燥。以上反應(yīng)皆為避光處進(jìn)行。6、信號檢測加20μ1 2mg/ml DAPI熒光染液于玻片上，蓋上封口膜，染色5min，揭掉封口膜，加20 μ I抗熒光淬滅封片液,蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察。
熒光原位雜交染色體需在7天內(nèi)進(jìn)行鏡檢，可置于4°C冰箱避光短期保存。鏡檢時再加DAPI復(fù)染。用Olympus BX-51突光顯微鏡觀察雜交信號，利用Cytovision軟件進(jìn)行拍照，Photoshop軟件進(jìn)行圖像處理。信號位點(diǎn)分布圖、中期分裂相圖、Dig雜交信號效果圖及染色體核型圖分別為圖1、2、3、4所示。染色體用DAPI復(fù)染色，呈現(xiàn)藍(lán)色，圖3箭頭示雜交信號位點(diǎn)。實(shí)施例2與實(shí)施例I所不同的是梅花品種為‘小宮粉’。其步驟及信號 觀察均同實(shí)施例I。結(jié)果分析從圖4和圖8中可見，用Dig標(biāo)記的45SrDNA探針與梅花染色體制片雜交具有6個雜交信號，信號點(diǎn)分布位于第1、3、7對同源染色體上。其中信號I號同源染色體信號最強(qiáng)，7號同源染色體信號最弱，3號同源染色體信號強(qiáng)度居中，不同品種略有差別。染色體核型公式為2n=2x=16=10m(2SAT)+6sm。信號點(diǎn)均位于染色體短臂的末端,很好的區(qū)分了形態(tài)相似的非同源染色體，較大程度的輔助核型分析，提高核型的精確度。梅花染色體一般都較小，最小的不足Ιμπι，核型分析難度較大。本發(fā)明的FISH方法使得梅花染色體核型分析的難度大大降低，通過信號點(diǎn)位置、強(qiáng)弱等，有效區(qū)分形態(tài)相似的非同源染色體；通過對有絲分裂和減數(shù)分裂染色體進(jìn)行定位，鑒定雜交品種攜帶45SrDNA為同源染色體；根據(jù)45SrDNA位點(diǎn)隨細(xì)胞鍵鼠分裂過程的位置變化，平均構(gòu)型2n=2x,鑒定染色體配對行為正常；通過45SrDNA雜交信號結(jié)合染色體形態(tài)判斷隨體存在。45SrDNA作為染色體的一個識別指標(biāo)間接地觀察細(xì)胞減數(shù)分裂過程染色體的變化行為，為了解雜交育種植物的遺傳背景、梅花品種的遺傳改良提供細(xì)胞及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種梅花染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于以梅花中期染色體作為靶DNA，以玉米45SrDNA為探針進(jìn)行梅花染色體熒光原位雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)染色體玻片標(biāo)本的制備與預(yù)處理； 2)探針標(biāo)記與探針變性； 3)探針與染色體共變性； 4)雜交與雜交后洗脫； 5)信號檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述染色體玻片標(biāo)本的制備為以梅花莖尖為材料，采用去壁低滲火焰干燥法制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述預(yù)處理為將所述染色體玻片標(biāo)本干燥，RNaseA、胃蛋白酶K處理，乙醇脫水。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述探針標(biāo)記為將30-50ng/yI玉米 45SrDNA 質(zhì)粒 1-3 份、DIG-Nick translation mix 或 Biotin-Nick translation mix4份和ddH20 13-15份按體積比混合，10_15°C避光反應(yīng)60_90min，加入EDTA I份，得探針標(biāo)記混合液，優(yōu)選玉米45SrDNA質(zhì)粒為3份，ddH20為13份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述探針變性為將所述探針標(biāo)記混合液1-4份和10mg/ml鮭魚精溶液4份按體積比混合，60_65°C烘烤；加入50%去離子甲酰胺10份、20 X SSC溶液2份、50%DS溶液4份，95°C避光變性lOmin，得變性探針，優(yōu)選探針標(biāo)記混合液為2份。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述探針與染色體共變性為將變性后的探針加到染色體玻片標(biāo)本上，共變性，變性溫度85°C，變性時間2-4min，優(yōu)選變性時間為3min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述雜交為將共變性后的探針與染色體玻片標(biāo)本于37°C黑暗培養(yǎng)18-24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述雜交后洗脫為將雜交后的染色體玻片標(biāo)本依次放入2 X SSC溶液，洗2 X 5min ;放入2 X SSC溶液，42°C恒溫IOmin ;放入IXPBS溶液，洗5min。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述信號檢測為加2mg/mlDAPI熒光染液于染色體玻片標(biāo)本上，染色時間5-8min，進(jìn)行檢測，優(yōu)選染色時間5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種梅花染色體的熒光原位雜交方法，以梅花中期染色體作為靶DNA，以玉米45SrDNA為探針，用缺刻平移法標(biāo)記探針，將玉米45SrDNA探針清晰的定位在梅花染色體上。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，對共變性方法進(jìn)行改進(jìn)，采用探針變性、染色體和探針共變性兩步來完成變性過程，大大提高雜交成功率。本發(fā)明確定了合適的變性溫度和變性時間，雜交時間和洗脫方法，雜交特異性高，使得FISH技術(shù)很好的應(yīng)用于梅花等小染色體植物的染色體檢測，為梅花染色體深入研究，提供了新的途徑和方法。
文檔編號G01N21/64GK102787166SQ201210245928
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者張啟翔, 楊冰潔, 楊煒茹, 羅樂, 陳晶鑫 申請人:北京林業(yè)大學(xué)