專利名稱：氧化分解后的白朮揮發(fā)油的hplc指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥材中抗癌有效成分指紋圖譜的建立方法，具體是一種氧化分解后的白朮揮發(fā)油的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白Jtt為臨床常用中藥之一，為菊科植物白Jtt (Atractylodes macrocephalaKoid.)的干燥根莖，主產(chǎn)于浙江、安徽等地。白朮揮發(fā)油是白朮抗腫瘤活性部位，在白朮中約含1.4%，揮發(fā)油中約含40種不同化學(xué)物質(zhì)，含量最高的成分是蒼術(shù)酮，占揮發(fā)油總量的60%。
目前，多采用氣相色譜法對白朮揮發(fā)油中的化學(xué)成分及其相對含量進行分析。但是，白朮揮發(fā)油與其他藥材揮發(fā)油明顯不同，白朮揮發(fā)油中蒼朮酮的性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化分解，采用氣相色譜對白朮揮發(fā)油進行分析測定過程中，測定程序的升溫過程會對揮發(fā)油中不穩(wěn)定成分及蒼朮酮的穩(wěn)定造成影響，氧化分解前、后的GS-MS色譜圖明顯不同。查閱文獻可知，有采用HPLC法，對氧化分解前白朮揮發(fā)油中單一成分一蒼朮酮的定量分析；在指紋圖譜的研究中，有報道采用GS法探討了不同提取方法得到的揮發(fā)油其色譜結(jié)果差異；采用直觀推導(dǎo)式演進特征投影算法，比較不同產(chǎn)地白朮揮發(fā)油GS-MS數(shù)據(jù)，以白朮揮發(fā)油質(zhì)控表征白術(shù)藥材的質(zhì)量控制；采用高效毛細管電泳法比較了不同產(chǎn)地白朮藥材指紋圖譜差異，建立白朮藥材指紋圖譜分析方法。目前白朮揮發(fā)油藥用研究主要是集中在氧化分解前的白朮揮發(fā)油，焦點是如何阻止其中含量多、性質(zhì)不穩(wěn)定成分一蒼朮酮的氧化分解。但是上述對氧化分解前白朮揮發(fā)油的質(zhì)量評價方式單一，不足以系統(tǒng)、全面的表明氧化分解后的白朮揮發(fā)油的整體質(zhì)量，亟需探索可全面反映氧化分解后的白朮揮發(fā)油質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)控制手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種氧化分解后的白朮揮發(fā)油的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法，為氧化分解后的白朮揮發(fā)油的藥用原料、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝流程中的各個步驟的質(zhì)量控制提供依據(jù)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油為由白朮藥材中提取得到的白朮揮發(fā)油經(jīng)氧化分解后，其中蒼朮酮的分解率達100%的白朮揮發(fā)油，所述的建立方法包括以下步驟
(1)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液為供試品溶液；
(2)混合對照品溶液的制備用乙腈溶解精密稱取的蒼朮酮、￠-桉葉醇、白朮內(nèi)酯I、白朮內(nèi)酯III，制得混合溶液A ;精密稱取P -欖香烯，用體積比為I: I的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成濃度為IOOPg ml/1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成蒼Jtt酮0. 60mg mL' P -桉葉酉享0. 40mg mL'白Jtt內(nèi)酯I 50Mg mL'白Jtt內(nèi)酯III 40I^g mL' P -欖香烯20Mg ml/1的混合對照品溶液；
(3)指紋圖譜的制作
色譜條件Hypersil ODS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長200nm 240nm,流動相流速為I. OmL柱溫為室溫；流動相A為乙腈，流動相為B為水，流動相A與B的體
積比為 60:40，采用線性梯度洗脫方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B ；在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析，得到氧化分解后的白朮揮發(fā)油的指紋圖譜。由白朮中提取得到的白朮揮發(fā)油的氧化分解可通過多種方式，例如室外光照及室外非光照下放置，室內(nèi)適宜溫度加熱或室內(nèi)放置等。本發(fā)明所述的氧化分解的方式由白朮中提取得到的白朮揮發(fā)油的氧化分解是通過將白朮揮發(fā)油置于密閉、透光的玻璃容器中， 并將玻璃容器置于室外非光照條件下進行氧化分解。本發(fā)明所述的氧化分解方式使得白朮揮發(fā)油中的不穩(wěn)定成分完全氧化分解，氧化分解后的白朮揮發(fā)油各成分相對穩(wěn)定。所述的指紋圖譜建立方法中進行高效液相色譜分析時，最佳采樣時間為40min。所述的白朮揮發(fā)油中的蒼朮酮的分解率的檢測是采用高效液相色譜檢測的，所述的檢測方法為
(1)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液為供試品溶液；
(2)對照品溶液的制備精密稱取蒼朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液為對照品溶液；
(3)蒼朮酮分解率的檢測
色譜條件Hypersil 0DS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長220nm,流動相流速為
I.OmL HiirT1，柱溫為室溫；流動相A為體積比為35:30:35的甲醇-乙腈-水，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積比為20:80 ;
在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析。進一步，本發(fā)明采用同一個氧化分解前的白朮揮發(fā)油供試品，以蒼朮酮的最大吸收波長220nm為檢測波長，比較各流動相獲得的蒼朮酮峰面積，確認(rèn)流動相乙腈_水作為氧化分解前、后的白朮揮發(fā)油的HPLC色譜條件更加科學(xué)。進一步，按照本發(fā)明所述的建立方法，使用選定的、不同的檢測波長進行高效液相分析，對不同檢測波長下的色譜數(shù)據(jù)進行匯總分析，確定了 200nm 240nm之間的任意檢測波長均可體現(xiàn)氧化分解后的白朮揮發(fā)油中各物質(zhì)的相對含量。進一步，本發(fā)明選取不同產(chǎn)地的白朮藥材，提取揮發(fā)油，獲得氧化分解后的白朮揮發(fā)油，按本發(fā)明所述的方法進行高效液相色譜分析，通過210、220、240nm三個選定的檢測波長，采集、分析及比較色譜圖，確定了其共有模式。在以下的實驗中，未詳細描述的各種過程、方法、儀器、試劑是本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法。實驗I :流動相的選擇對比考察
I.I儀器與試劑高效液相色譜儀，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，三組流動相分別為
I組流動相A為甲醇，B為水；
II組流動相A為乙腈，B為水；
III組流動相A為體積比為60:40的甲醇-乙腈，B為水。I. 2分析方法色譜條件Hypersil 0DS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長220nm，流動相流速為I. OmL mirT1，柱溫為室溫；流動相A與B的體積比為70:30，采用線性梯度洗脫方式0-30min，70%A — 100%A。I. 3供試品溶液的制備
白朮藥材干燥根莖，粉碎，粉末顆粒100%過20目篩；采用超臨界二氧化碳萃取法 (SPE法)，萃取得到白朮揮發(fā)油；用乙腈溶解白朮揮發(fā)油配制成I. 5mg mL-1的溶液。1.4 HPLC 結(jié)果
三組流動相的色譜結(jié)果見圖I至圖3。色譜結(jié)果分析
I)由圖I看出，色譜基線漂移嚴(yán)重，成45度傾斜。實驗過程記錄表明，柱壓很高，在200Pka以上。蒼朮酮的峰面積1190。2)由圖2看出，色譜基線相對平穩(wěn)。實驗過程記錄表明，柱壓較低，由113Pka梯度前變成50Pka梯度后。蒼朮酮的峰面積2236。3)由圖3看出，色譜基線漂移嚴(yán)重，成35度傾斜。實驗過程記錄表明，柱壓由梯度前的142Pka變成梯度后121Pka。蒼朮酮的峰面積1413。4) III組流動相的蒼朮酮的峰面積1413與I組的相比，蒼術(shù)酮的峰面積增加18. 74% ； II組流動相的蒼術(shù)酮的峰面積2236與I組的相比，蒼術(shù)酮的峰面積增加87. 90%。據(jù)此認(rèn)為，II組(流動相A為乙腈，B為水)流動相較III組和I組流動相的靈敏度更高，柱壓低，基線平穩(wěn)。選擇II組(流動相A為乙腈，B為水)流動相作為揮發(fā)油色譜圖采集更加科學(xué)。實驗2 :不同檢測波長的高效液相色譜法指紋圖譜分析考察
2.I白朮揮發(fā)油的提取
白朮藥材干燥根莖，粉碎，粉末顆粒100%過20目篩；采用超臨界二氧化碳萃取法(SPE法)，萃取得到白朮揮發(fā)油。2. 2氧化分解后的白朮揮發(fā)油的制備
2.2. I白朮揮發(fā)油的處理由白朮中提取得到的白朮揮發(fā)油的氧化分解是通過將白朮揮發(fā)油置于密閉、透光的玻璃容器中，并將玻璃容器置于室外非光照條件下進行氧化分解。2. 2. 2所述的白朮揮發(fā)油中的蒼朮酮的分解率的檢測是采用高效液相色譜檢測的，所述的檢測方法為
(1)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成
I.5mg mL—1的溶液，此溶液為供試品溶液；
(2)對照品溶液的制備精密稱取蒼朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液為對照品溶液；
(3)蒼朮酮分解率的檢測
色譜條件Hypersil 0DS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長220nm,流動相流速為I. OmL IirT1,柱溫為室溫；流動相A為體積比為35:30:35的甲醇-乙腈-/K，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積比為20:80 ;
在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析。直到蒼朮酮的分解率達到100%，得到氧化分解后的白朮揮發(fā)油。2. 3供試品溶液的制備
精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg ml/1的溶液，此溶液為供試品溶液。2. 4混合對照品溶液的制備· 用乙腈溶解精密稱取的蒼朮酮、￠-桉葉醇、白朮內(nèi)酯I、白朮內(nèi)酯III，制得混合溶液A ;精密稱取欖香烯，用體積比為1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成濃度為100吒 mL—1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成蒼朮酮0. 60mg mL'3 -桉葉醇 0. 40mg mL' 白 Jtt 內(nèi)酯 I 50Mg mL' 白 Jtt 內(nèi)酯III 40I^g mL' P -欖香烯20Mg ml/1的混合對照品溶液。2. 5指紋圖譜分析
2.5. I供試品溶液的指紋圖譜分析
色譜條件Hypersil 0DS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長為200nm 240nm,流動相流速為I. OmL柱溫為室溫；流動相A為乙腈，流動相為B為水，流動相A與B的
體積比為 60:40，采用線性梯度洗脫方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B。在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液5W進樣量，進行高效液相色譜分析。2. 5. 2混合對照品溶液的指紋圖譜分析
色譜條件Hypersil 0DS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長210nm,流動相流速為I. OmL mirT1,柱溫為室溫；流動相A為乙腈,流動相為B為水,流動相A與B的體積比為60:40，采用線性梯度洗脫方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B。在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液5W進樣量，進行高效液相色譜分析。2. 6色譜圖處理
色譜圖積分條件設(shè)置峰高> 2，峰面積> 10，保留時間5min之前的峰定為試劑峰。2. 7色譜結(jié)果
在上述色譜條件下，采集的檢測波長分別為200nm、205 nm、210 nm、215 nm、220 nm、230nm、240nm的供試品溶液色譜圖以及檢測波長為210 nm的混合對照品溶液色譜圖見

圖11，圖中1_白朮內(nèi)酯III，2-@-桉葉醇，3-白朮內(nèi)酯I ,4-蒼朮酮，5-3-欖香烯；各檢測波長采集的色譜圖見圖4至圖11。對圖4至圖10中的色譜數(shù)據(jù)進行匯總，結(jié)果見表I。表I不同檢測波長的色譜分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油為由白朮藥材中提取得到的白朮揮發(fā)油經(jīng)氧化分解后，其中蒼朮酮的分解率達100%的白朮揮發(fā)油，所述的建立方法包括以下步驟 (1)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液為供試品溶液； (2)混合對照品溶液的制備用乙腈溶解精密稱取的蒼朮酮、￠-桉葉醇、白朮內(nèi)酯I、白朮內(nèi)酯III，制得混合溶液A ;精密稱取P -欖香烯，用體積比為I: I的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成濃度為IOOPg ml/1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成蒼Jtt酮0. 60mg mL' P -桉葉酉享0. 40mg mL'白Jtt內(nèi)酯I 50Mg mL'白Jtt內(nèi)酯III 40I^g mL' P -欖香烯20Mg ml/1的混合對照品溶液； (3)指紋圖譜的制作 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長200nm 240nm,流動相流速為I. OmL柱溫為室溫；流動相A為乙腈，流動相為B為水，流動相A與B的體積比為 60:40，采用線性梯度洗脫方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B ； 在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析，得到氧化分解后的白朮揮發(fā)油的指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，由白朮中提取得到的白朮揮發(fā)油的氧化分解是通過將白朮揮發(fā)油置于密閉、透光的玻璃容器中，并將玻璃容器置于室外非光照條件下進行氧化分解。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述的指紋圖譜建立方法中進行高效液相色譜分析時，采樣時間為40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述的白朮揮發(fā)油中的蒼朮酮的分解率的檢測是采用高效液相色譜檢測的，所述的檢測方法為 (1)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mr1的溶液，此溶液為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備精密稱取蒼朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液為對照品溶液； (3)蒼朮酮分解率的檢測 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長220nm,流動相流速為I. OmL HiirT1，柱溫為室溫；流動相A為體積比為35:30:35的甲醇-乙腈-水，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積比為20:80 ; 在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的氧化分解后的白朮揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述的白朮揮發(fā)油中的蒼朮酮的分解率的檢測是采用高效液相色譜檢測的，所述的檢測方法為 (I)供試品溶液的制備精密稱取氧化分解后的白朮揮發(fā)油供試品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mr1的溶液，此溶液為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取蒼朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液為對照品溶液； (3)蒼朮酮分解率的檢測 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;檢測波長220nm,流動相流速為I.OmL HiirT1，柱溫為室溫；流動相A為體積比為35:30:35的甲醇-乙腈-水，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積比為20:80 ; 在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5W進樣量，進行高效液相色譜分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥材中抗癌有效成分指紋圖譜的建立方法，具體是一種氧化分解后的白朮揮發(fā)油的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法，包括供試品溶液的制備、混合對照品溶液的制備、指紋圖譜的制作，通過對4個產(chǎn)地的氧化分解后的白朮揮發(fā)油HPLC指紋圖譜對比，確定了其共有峰。采用本發(fā)明所提供的方法所建立的HPLC指紋圖譜，可有效地表征氧化分解后的白朮揮發(fā)油的質(zhì)量，有利于控制氧化分解后的白朮揮發(fā)油的藥用原料、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝流程中的各個步驟的質(zhì)量。
文檔編號G01N30/06GK102798686SQ201210254120
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者閻克里 申請人:山西省腫瘤醫(yī)院