專利名稱：使用激光粒度儀實測微囊藻密度及群體大小的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用激光粒度儀實測微囊藻密度及群體大小的方法。通過這種方法的使用，能夠通快速并同時測定微囊藻密度及群體粒徑分布。與以往一些測定微囊藻密度及群體大小的方法不同的是，此方法能夠同時測定微囊藻密度及群體大小，不需要破碎微囊藻群體，也不需要花費大量時間用顯微鏡測量微囊藻群體大小，此方法不僅能夠迅速得出微囊藻密度及群體大小，而且可以獲得微囊藻群體的粒徑分布。本發(fā)明屬于資源環(huán)境領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藍藻水華一般以微囊藻的大量繁殖、富集較為普遍。湖泊中微囊藻細(xì)胞密度是水華研究、預(yù)測、防治的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。一般對微囊藻的生物量的研究多基于細(xì)胞密度的測定，如顯微鏡計數(shù)、分光光度法、葉綠素含量，都常用來評價微囊藻的生物量。在研究群體數(shù)目、群體大小、群體細(xì)胞數(shù)時顯微鏡觀察會出現(xiàn)一定的局限性，雖然群體的數(shù)量通過計數(shù)易于 獲取，但是每個群體構(gòu)成的細(xì)胞數(shù)則由于群體細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)和相互遮擋難以計數(shù)。在用顯微鏡觀測微囊藻群體時，由于取樣量(O. μ -0. ImL)較小，并且常要進行I倍 10倍稀釋，視野中出現(xiàn)的群體數(shù)量和大小存在較大的偶然性，這會造成評價結(jié)果的代表性變差。同時，在進行群體評價時每個樣品都要數(shù)到40(Γ600個藻單元，工作量也非常巨大。顯微鏡觀測對于浮游植物分類以及單細(xì)胞藻類的生物量實測方面發(fā)揮重要作用，但在以群體形態(tài)出現(xiàn)的微囊藻的群體特征評價時存在操作性和準(zhǔn)確性方面的問題。因此，尋求一種簡易的、對野外及室內(nèi)樣品都適用的、既能評價微囊藻總細(xì)胞密度又能對群體大小以及群體粒徑分布進行評價的方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種能夠通快速并同時測定微囊藻密度及群體大小和粒徑分布的方法。通過采用本發(fā)明專利的測定方法，能夠快速測定微囊藻密度及群體大小相關(guān)數(shù)據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案，其特征是對實際湖泊中獲得的微囊藻樣品進行簡單預(yù)處理，直接通過激光粒度儀測定，便可以計算獲得微囊藻密度及群體大小和粒徑分布的數(shù)據(jù)。在微囊藻漂浮較為明顯的水面用65Mffl浮游動物網(wǎng)進行撈取，通過福爾馬林固定后帶回實驗室保存。野外采取的樣品因為懸浮泥沙較多，需先進行預(yù)處理。利用懸浮泥沙等雜物比重大沉降快的特點，將樣品在500mL水樣瓶內(nèi)進行12小時靜置。待泥沙、雜物沉降到水樣瓶下部后，提取上部干凈藻液。同時補充與底部雜液相同量的蒸餾水以保證藻液的原始密度。室內(nèi)純培養(yǎng)的藻樣可以直接進行測試。激光粒度儀分析采用英國馬爾文公司MastersizdOOO激光粒度儀。通過顯微鏡觀察與參考吸收率圖集比對，設(shè)定激光粒度儀吸收率為O. 1，通過嘗試設(shè)定折射率為I. 40，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速為1500rad/min保證充分混合又沒有明顯氣泡。首先，加入V1 (600-700mL)體積的清水掃描背景值，再逐步加入被測樣品，同時觀測遮光度的變化，當(dāng)遮光度達到10 20%時記錄加入樣品的量V2和對應(yīng)的遮光度Ov，然后通過測定可以獲得樣品的粒徑分布，通過V1;V2和Ov可以計算微囊藻密度，激光粒度儀除獲得液體中懸浮顆粒的總遮光度的同時獲得微囊藻群體大小和粒徑分布。


圖I為細(xì)胞密度與遮光度的關(guān)系；
圖2為細(xì)胞密度與顯微鏡計數(shù)結(jié)果對比； 圖3為4種試驗樣品中不同粒徑所占總體積百分比的實測結(jié)果(a，11個；b，5個；C，4個；d，4個)。
具體實施例方式實施案例
(I)儀器及樣品
測試采用英國馬爾文公司Mastersize2000激光粒度儀。微囊藻藻種取于中科院水生所，使用BG-Il培養(yǎng)基培養(yǎng)于250ml錐形瓶中，光照強度5 50μΕ · m_2 · s_l，培養(yǎng)溫度25°C，光暗比12 :12小時。在不同光強、擾動條件下進行培養(yǎng)，得到了群體特征各不相同的3種樣品肉眼以及顯微鏡觀測都能明確判別a類樣品以單細(xì)胞為主，共計24個，b樣品以群體為主，共計13個，c樣品單細(xì)胞、小群體與較大群體混合共計9個。2010年6月，取樣位置是太湖貢湖灣，在微囊藻漂浮較為明顯的水面用63Mm浮游動物網(wǎng)進行撈取，通過福爾馬林固定后帶回實驗室保存。肉眼以及顯微鏡觀測都能明確判別微囊藻以大群體形態(tài)存在，偶見單細(xì)胞及小群體(d，樣品共計13個)。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
對4種樣品分別進行了顯微鏡觀察和激光粒度儀分析。顯微鏡觀察樣品a直接通過顯微鏡計數(shù)得到藻密度Dm，b、C、d樣品通過加堿煮沸的方法將微囊藻群體分散后進行細(xì)胞計數(shù)得到藻密度Dm。激光粒度儀分析采用英國馬爾文公司Mastersize2000激光粒度儀。通過顯微鏡觀察與參考吸收率圖集比對，設(shè)定激光粒度儀吸收率為0.01，通過嘗試設(shè)定折射率為
I.50，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速為1500rad/min保證充分混合又沒有明顯氣泡。首先，加入V1^OO-TOOmL)體積的清水掃描背景值，再逐步加入被測樣品，同時觀測遮光度的變化，當(dāng)遮光度達到10 20%時記錄加入樣品的量V2和對應(yīng)的遮光度Ov，然后測定樣品的粒徑分布。利用懸浮顆粒遮光度的原理，使用激光粒度儀對微囊藻細(xì)胞數(shù)進行了實測。體積為V2的樣品遮光度0M，可根據(jù)稀釋后測得的遮光度Ov和稀釋液的體積V1,按照公式(2)計算
Om=Ov (VV2)/V2⑵
用這一方法對4種，共35個樣品(a，13個；b8個；C，5個；d，9個)的遮光度進行了實測，同時通過顯微鏡對細(xì)胞密度進行了實測，將細(xì)胞密度與遮光度的關(guān)系繪制成圖I。從實測數(shù)據(jù)可以看出兩者之間存在非常明顯的線性相關(guān)關(guān)系，得到細(xì)胞密度與遮光度之間的換算公式(3)
Dc=kOM(3)
式中D。為通過激光粒度儀間接測定的細(xì)胞密度，k為遮光度系數(shù)通過本次實驗得到室內(nèi)培養(yǎng)樣品k=22. 98;野外樣品k=9. 03。(3)測定樣品的藻密度
為了證明這一方法的準(zhǔn)確性，對4種樣品中未使用的24個樣品(a, 11個；b，5個；C，4個；d，4個)使用了激光粒度儀進行測定，獲取的細(xì)胞密度與顯微鏡計數(shù)結(jié)果對比，結(jié)果見圖2。由圖2可見激光粒度儀獲得的結(jié)果與顯微鏡獲得的結(jié)果基本一致。(4)微囊藻群體大小和粒徑分布
激光粒度儀除獲得液體中懸浮顆粒的總遮光度的同時，可以獲得樣品的粒徑大小和粒徑分布曲線。4種試驗樣品中不同粒徑所占總體積百分比的實測結(jié)果見圖3。
權(quán)利要求
1.、一種使用激光粒度儀實測微囊藻密度及群體大小的方法，其特征在于按如下步驟實現(xiàn) A、現(xiàn)場樣品預(yù)處理的方法為將樣品在500mL水樣瓶內(nèi)進行12小時靜置；待泥沙、雜物沉降到水樣瓶下部后，提取上部干凈藻液；同時補充與底部雜液相同量的蒸餾水以保證藻液的原始密度； B、采用激光粒度儀設(shè)定激光粒度儀吸收率為O.1，設(shè)定折射率為I. 40，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速為1500rad/min ； C、激光粒度儀測定的基本步驟為加入V1體積為600-700mL的清水掃描背景值，再逐步加入被測樣品，同時觀測遮光度的變化，當(dāng)遮光度達到10 20%時記錄加入樣品的量V2和對應(yīng)的遮光度Ov，然后通過測定可以獲得樣品的粒徑分布，通過V1J2和Ov可以計算微囊藻密度； D、細(xì)胞密度與遮光度之間的換算公式為De=kOM，其中，D。為通過激光粒度儀間接測定的細(xì)胞密度，k為遮光度系數(shù)，Om為體積為V2的樣品遮光度；以上所述參數(shù)中，室內(nèi)樣品k=22. 98;野外樣品 k=9. 03; 其中體積為V2的樣品遮光度Om可根據(jù)稀釋后測得的遮光度Ov和稀釋液的體積V1通過公示計算，其特征為Om=Ov (VfV2) /V2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用激光粒度儀實測微囊藻密度及群體大小的方法，通過對現(xiàn)場樣品預(yù)處理，利用激光粒度儀能夠通快速并同時測定微囊藻密度及群體粒徑分布。具體實施步驟如下步驟一，將樣品靜置12h，收集上清液并補充與底部雜液相同量的蒸餾水；步驟二，設(shè)定激光粒度儀吸收率為0.1，設(shè)定折射率為1.40，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速為1500rad/min；步驟三，加入V1(600-700mL)體積的清水掃描背景值，再逐步加入被測樣品，當(dāng)遮光度達到10～20％時記錄加入樣品的量V2和對應(yīng)的遮光度OV，然測定微囊藻粒徑分布并計算微囊藻密度。
文檔編號G01N15/02GK102818755SQ20121025425
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者朱偉, 李明, 李林, 羅永剛, 代曉炫, 肖曼, 郭麗麗 申請人:河海大學(xué)