專利名稱：僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)評價指標(biāo)篩選領(lǐng)域，具體涉及一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法。
背景技術(shù)：
卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物，它含有6000多種化學(xué)物質(zhì)，卷煙燃燒是一個非常復(fù)雜的物理化學(xué)過程，由于煙草組分的熱分解和燃燒等反應(yīng)會生成大量化學(xué)物質(zhì)，其中有CO、自由基、多環(huán)芳烴(PAHs)、雜環(huán)化合物、醌類、酚類、醛類、酮類、酸類、酯類、脂肪族化合物等有機(jī)成分，還包含有痕量的無機(jī)元素如Fe、Cu、Cr、Cd、Zn等。而高濃度的自由基以及可與其他物質(zhì)反應(yīng)而生成活性物質(zhì)的化學(xué)成分如CO、醛類及多環(huán)芳烴類等活性物質(zhì)可損傷細(xì)胞，攻擊DNA，形成共價的DNA加合物，引起DNA堿基錯配，DNA單鏈或雙鏈斷裂，導(dǎo)致DNA損傷，從而引起機(jī)體各種機(jī)能的變化。
因此吸煙是一個主要的健康風(fēng)險因素，會增加包括呼吸道感染、慢性阻塞性肺炎、肺癌、心臟病等各種疾病的發(fā)病率(Talhout R, Schulz T, Florek E, et al. Hazardouscompounds in tobacco smoke. Int J Environ Res Public Health. 2011,8(2) :613-28.)。卷煙點(diǎn)燃時所釋放的焦油和一氧化碳等化學(xué)物質(zhì)，可以刺激呼吸道，損傷血管內(nèi)膜，降低紅血球輸氧能力，增加心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。吸煙是一種損傷和促炎反應(yīng)，及免疫抑制因素(Patel RR, Ryu JH, Vassallo R. Cigarette smoking anddiffuse lung disease. Drugs 2008 ；68 :1511-1527 ；Kim V, Rogers TJ, Criner GJ. Newconcepts in the pathobiology of chronic obstructive pulmonary disease. Proc AmThorac Soc 2008 ;5 :478-485.)，有證據(jù)顯示煙草煙霧會破壞呼吸道上皮的屏障功能，巨噬細(xì)胞功能被抑制，淋巴細(xì)胞凋亡增加，炎癥局部淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增加，毒性T淋巴細(xì)胞比例增加(Tc)，炎性細(xì)胞因子分泌活躍(包括IL-6、IL-8、IL-1P、TNF-a)，最終影響機(jī)體的天然和獲得性免疫功能(Domagala-Kulawik J. Effects of cigarette smokeon the lung and systemic immunity. J Physiol Pharmacol. 2008,59Suppl6 :19-34.)。其中，IL-6是由激活的T(Th2)細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞所分泌的致炎因子，在炎癥和急相性反應(yīng)中起重要作用。這些免疫功能的改變與煙草中大量有害成分含量密切相關(guān)。焦油是卷煙煙氣中主要的有害物質(zhì)，由多種烴及烴的氧化物、硫化物和氮化物等復(fù)雜化合物組成。焦油進(jìn)入生物活體后，引起細(xì)胞中如DNA、RNA、蛋白質(zhì)的損傷，從而干擾細(xì)胞正常機(jī)能。體外研究顯示焦油含量越高，對細(xì)胞的毒性作用也越強(qiáng)。體內(nèi)研究中，高焦油和低焦油香煙對機(jī)體的免疫損傷是否存在差異，這種差異與哪些因素相關(guān)，目前尚不清楚，也沒有相應(yīng)的報道。煙草對人體健康的不利影響已在全世界被廣泛報道，尋找穩(wěn)定敏感的免疫監(jiān)測指標(biāo)對監(jiān)測保護(hù)人群健康至關(guān)重要，監(jiān)測有害物質(zhì)含量與免疫功能變化的相關(guān)性對于減少和控制吸煙引起的相關(guān)疾病具有重要意義，但目前尚缺乏敏感穩(wěn)定的免疫評價指標(biāo)。因此，研究免疫功能評價指標(biāo)，篩選出敏感穩(wěn)定的免疫評價指標(biāo)對科學(xué)降低卷煙的危害性具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法，篩選結(jié)果比較科學(xué)全面。—種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法，包括以下步驟(I)以吸空氣大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為正常對照組，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙的大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為吸煙組；(2)利用MTT增殖法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞增殖能力，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄；(3)利用雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)法檢測步驟(I)中各組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分比(即吞噬百分率)和吞噬指數(shù)，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄；(4)利用ELISA法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中IL-6及TNF-a細(xì)胞因子濃度，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄；(5)檢測步驟(I)中各組血清中總免疫球蛋白(Ig)含量、IgG含量及IgE含量，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo),反之，放棄;(6)利用瑞氏染液染色法檢測步驟(I)中各組血液中白細(xì)胞分類計數(shù)，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。步驟(2)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞
IX IO6個/ml加入培養(yǎng)板，每孔0. 1ml，再加入刺激細(xì)胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為IOy g/ml，作為加刺激細(xì)胞組，并設(shè)不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，每孔加入10 ylMTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，放回培養(yǎng)箱孵育后加入MTT溶媒100 iil/孔，在570nm波長處測OD值，淋巴細(xì)胞的增值能力以刺激指數(shù)表示，刺激指數(shù)=加刺激細(xì)胞組OD值/陰性對照組OD值，比較各組刺激指數(shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該刺激指數(shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。步驟(3)具體步驟包括將步驟(I)中各組純化的腹腔巨噬細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成IO6個/ml，加入5 %的雞紅細(xì)胞懸液0. 04ml，其中雞紅細(xì)胞IO7個/ml，置于37°C水浴中孵育15-30min，離心，棄上清，將沉淀的雞紅細(xì)胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，顯微鏡下觀察100個巨噬細(xì)胞，計數(shù)吞噬百分比和吞噬指數(shù)，吞噬百分率=吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞，吞噬指數(shù)=100個巨噬細(xì)胞中所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞，比較各組吞噬百分比和吞噬指數(shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該吞噬百分比和吞噬指數(shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
步驟(4)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞IXlO6個/ml加入培養(yǎng)板，每孔Iml,再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為10 ii g/ml,并設(shè)不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，離心收集上清液即脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液，收集的上清液與步驟(I)中各組大鼠血清中IL-6與TNF- a采用大鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒進(jìn)行ELISA法檢測，細(xì)胞因子濃度依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，比較各組細(xì)胞因子濃度，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該IL-6和/或TNF-a細(xì)胞因子作為評價指標(biāo)，反之，放棄。步驟(5)具體步驟包括培養(yǎng)板每孔加入步驟(I)中各組大鼠血清稀釋液100 iil，復(fù)孔，血清樣本用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG, HRP-羊抗大鼠IgE抗體作為二抗，四甲基聯(lián)苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值；血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算；比較各組總Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與 正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該總Ig、IgG、IgE中的一種或幾種作為評價指標(biāo)，反之，放棄。步驟(6)具體步驟包括將步驟(I)中各組大鼠血液加入適量肝素鈉，制備血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然溫度下染色10分鐘-15分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢，記錄各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)；比較各組各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。步驟(I)中，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙的時間為30天、60天、90天以及經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復(fù)期，如經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙30天大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙60天大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙90天大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液，以及經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復(fù)期大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液。步驟(I)中，所述卷煙包括焦油含量為8mg/支的低焦油卷煙和/或焦油含量為12mg/支或13mg/支的普通卷煙。所述的大鼠為SD大鼠。本發(fā)明試劑均采用市售產(chǎn)品。本發(fā)明顯示,相比于細(xì)胞免疫反應(yīng),體液免疫更容易受到吸煙的損傷,也更容易恢復(fù)至正常水平；低焦油卷煙組在短期內(nèi)免疫損傷不及普通卷煙，但長期吸食，對機(jī)體造成的免疫損傷和普通卷煙相似甚至更為嚴(yán)重。綜上，最終篩選出脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)(SI)、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6含量、血清中IgG含量、血清中IgE含量及血液中各類白細(xì)胞比例五個指標(biāo)作為敏感穩(wěn)定的評價指標(biāo)反應(yīng)吸煙大鼠免疫功能的變化。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過對經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙大鼠血清、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液等體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能的變化情況的分析，研究卷煙煙氣對機(jī)體免疫功能的影響，篩選出若干免疫監(jiān)測指標(biāo)。篩選出的指標(biāo)敏感穩(wěn)定好，可作為反應(yīng)吸煙大鼠免疫功能的變化的評價指標(biāo)，反映吸煙這一外來的理化刺激引起的機(jī)體免疫功能損傷。本發(fā)明進(jìn)一步通過對不同吸煙時間(30、60、90天)大鼠脾淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的功能測定，血清中總免疫球蛋白(Ig)含量、免疫球蛋白亞類IgG及IgE含量等測定，脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中炎癥因子(IL-6、TNF- a )含量等測定以及血液中各種白細(xì)胞含量的測定，反映吸煙大鼠體液和細(xì)胞免疫功能的變化，及高低焦油量卷煙引起免疫損傷的差異，進(jìn)行指標(biāo)篩選，獲得簡便敏感的免疫功能評價指標(biāo)。本發(fā)明篩選方法可重復(fù)操作多次，經(jīng)多次重復(fù)操作，得出相同的篩選結(jié)果，表明本發(fā)明篩選方法準(zhǔn)確性較好，所篩選出的評價指標(biāo)可以全面科學(xué)的反應(yīng)卷煙煙氣對免疫功能的影響。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I材料與方法I.材料I. I實(shí)驗(yàn)動物，SD大鼠購自上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號碼SCXK (滬)2008-0016。No. I低焦油卷煙(焦油含量8mg/支)；No. 2普通卷煙(焦油含量13mg/支)由浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。I. 2 試劑Rat IL-6ELISA kit 和 Rat TNF- a ELISA kit 購自 R&D 公司，MTT 增殖檢測試劑盒購自SIGMA，Rat Ig ELISAkit購自藍(lán)基生物，一次性細(xì)胞計數(shù)板購自英俊公司，其他試劑為試劑級試劑。I. 3設(shè)備鼠經(jīng)鼻暴露吸煙系統(tǒng)(參考美國西北毒理研究中心Battelle公司的CSES系統(tǒng))，這個系統(tǒng)可直接與JJS-II型自動吸煙機(jī)連接。2.方法2. I動物實(shí)驗(yàn)2. I. I實(shí)驗(yàn)動物5周齡的健康Sprague-Dawley大鼠160只。隨機(jī)分為3組。A組,正常對照組,吸空氣，B組，吸No. I低焦油卷煙(焦油811^/支)，(組，吸如.2普通卷煙(焦油13mg/支)。實(shí)驗(yàn)材料及煙氣產(chǎn)生按IS03308和國家標(biāo)準(zhǔn)。在JJS-II型自動吸煙機(jī)上，按常規(guī)擬人吸煙條件下，每分鐘抽吸I 口，每口抽吸2秒。吸煙機(jī)房間環(huán)境溫度22±2°C、濕度60±5%。每一孔道處氣流的測定風(fēng)速值200±50mm/s。每次試驗(yàn)前須檢查每一通道的抽吸容量必須調(diào)整至35±0. 30ml。B，C組大鼠以僅鼻吸煙方式每天吸煙20支連續(xù)90天，停止吸煙42天。依據(jù)衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，大鼠吸煙30天、60天和90天，相當(dāng)于人吸煙3年、6年和9年。2. 2脾淋巴細(xì)胞功能檢測實(shí)驗(yàn)動物中的動物分別于吸煙30天、60天、90天和恢復(fù)期(吸煙90天后停吸，自然恢復(fù)42天，convalescence)取三組大鼠共108只，麻醉后眼球采血，分離血清,分裝后-80°C保存。
大鼠斷頸處死后，置體積百分濃度為75%乙醇水溶液中浸泡l_2min,右臥位,無菌取脾臟，稱重。在35mm培養(yǎng)皿中放入5mlEZ-S印TMM0use I X淋巴細(xì)胞分離液，用注射器活塞輕輕研磨大鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)進(jìn)入淋巴細(xì)胞分離液中。把懸有脾臟細(xì)胞的分離液轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，離心前再覆蓋200 ill的RPMI-1640培養(yǎng)基。800g離心30分鐘，吸出淋巴細(xì)胞層，再加入10mll640培養(yǎng)基，250g離心10分鐘，傾倒上清液，加A 3-5ml無血清培養(yǎng)基重懸,得到脾淋巴細(xì)胞,Invitrogen公司提供的countess細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將IX IO6個/ml的脾淋巴細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔0. lml。再加入伴刀豆蛋白(concanavalin A, ConA),使其終濃度為10 y g/ml,并設(shè)不加ConA的陰性對照和不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞置于5% (體積百分比)CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，加入MTT溶液(Sigma公司)，每孔10 U 1，將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱孵育3_4小時，加入MTT溶媒(Sigma公司UOOiU/孔，在570nm波長處測光吸收值(0D值)，淋巴細(xì)胞的增殖能力以刺激指數(shù)(stimulating index, SI)表示，SI =加刺激細(xì)胞ConA孔OD值/不加刺激細(xì)胞ConA的陰性對照孔OD值。OD值大于等于2提示淋巴細(xì)胞具有增殖功能。
2. 3腹腔巨噬細(xì)胞功能測定實(shí)驗(yàn)動物中的動物分別于吸煙30天，60天，90天，取大鼠12只(每組4只)，麻醉后眼球采血，分離血清，分裝后-80°C保存。大鼠斷頸處死后，置75% (質(zhì)量百分比)乙醇水溶液中浸泡l_2min，剪開腹部皮毛，在腹腔左下角注入IOml冷生理鹽水，輕揉大鼠腹部3-5min，無菌剪開腹腔，吸取腹腔液至15ml離心管中，lOOOrpm，離心5min。將細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)2h，去除淋巴細(xì)胞。將純化的巨噬細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成IO6個/ml，加入5% (體積百分比)的雞紅細(xì)胞懸液0.04ml (雞紅細(xì)胞IO7個/ml)，置于37°C水浴中孵育15_30min,期間每2_3min輕輕搖晃試管I次。500g離心5min,棄上清。將試管底部的雞紅細(xì)胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色。顯微鏡下(油鏡)觀察100個巨噬細(xì)胞，計數(shù)吞噬百分比和吞噬指數(shù)。吞噬百分率=吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞；吞噬指數(shù)=100個巨噬細(xì)胞中所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞。2. 4ELISA檢測IL_6、TNF_a及免疫球蛋白(Ig)含量將實(shí)驗(yàn)動物中的動物在不同時間點(diǎn)剖殺后取脾淋巴細(xì)胞，得到脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度至I X IO6個/ml加入24孔培養(yǎng)板，每孔lml。再加入ConA,使其終濃度為10 u g/ml，并設(shè)不加ConA的陰性對照，以及不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照。將細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，14000rpm離心lOmin，收集上清液，_80°C凍存待檢。收集的上清液與血清中IL-6與TNF-a采用大鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒(BD Biosciences, San Jose, CA)進(jìn)行ELISA法檢測，細(xì)胞因子濃度依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。每孔加入吸煙大鼠及對照組大鼠血清稀釋液100 U 1，復(fù)孔。血清樣本用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋(PBS, pH7. 4)。HRP-羊抗大鼠 Ig 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)、HRP-羊抗大鼠 IgG 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)、HR-羊抗大鼠 IgE 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)作為二抗，四甲基聯(lián)苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值。血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。2. 5血涂片的檢測將實(shí)驗(yàn)動物中的動物的血液加入肝素鈉少量，制備血涂片。待血涂片干透后，用蠟筆在兩端劃線，以防染色時染液外溢。血涂片用瑞氏染液進(jìn)行染色，室溫染色10分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢。記錄各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。2. 6統(tǒng)計方法統(tǒng)計方法采用SAS軟件的方差分析和t-檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，p < 0. 05認(rèn)為有顯著性差異。3.結(jié)果3. I.脾臟淋巴細(xì)胞功能檢測淋巴細(xì)胞增殖及刺激指數(shù)見表I。 表I各組期淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)
權(quán)利要求
1.一種擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)以吸空氣大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為正常對照組，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙的大鼠的血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為吸煙組； (2)利用MTT增殖法檢測步驟⑴中各組脾淋巴細(xì)胞增殖能力，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄； (3)利用雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)法檢測步驟(I)中各組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄； (4)利用ELISA法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中IL-6及TNF-a細(xì)胞因子濃度，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄； (5)檢測步驟(I)中各組血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄； (6)利用瑞氏染液染色法檢測步驟(I)中各組血液中白細(xì)胞分類計數(shù)，比較各組檢測結(jié)果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標(biāo)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞I X IO6個/ml加入培養(yǎng)板，每孔0. 1ml，再加入刺激細(xì)胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為10 U g/ml，作為加刺激細(xì)胞組，并設(shè)不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，每孔加入10 u I MTT溶液，放回培養(yǎng)箱孵育后加入MTT溶媒100 U I/孔，在570nm波長處測OD值，淋巴細(xì)胞的增值能力以刺激指數(shù)表示，刺激指數(shù)=加刺激細(xì)胞組OD值/陰性對照組OD值，比較各組刺激指數(shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該刺激指數(shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)具體步驟包括將步驟(I)中各組純化的腹腔巨噬細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成IO6個/ml，加入5%的雞紅細(xì)胞懸液0. 04ml，其中雞紅細(xì)胞IO7個/ml，置于37°C水浴中孵育15_30min，離心，棄上清，將沉淀的雞紅細(xì)胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，顯微鏡下觀察100個巨噬細(xì)胞，計數(shù)吞噬百分比和吞噬指數(shù)，吞噬百分率=吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞，吞噬指數(shù)=100個巨噬細(xì)胞中所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)X 100/100個巨噬細(xì)胞，比較各組吞噬百分比和吞噬指數(shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該吞噬百分比和吞噬指數(shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細(xì)胞IX IO6個/ml加入培養(yǎng)板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為IOy g/ml，并設(shè)不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細(xì)胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)68h，離心收集上清液即脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液，收集的上清液與步驟(I)中各組大鼠血清中IL-6與TNF-a采用大鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒進(jìn)行ELISA法檢測，細(xì)胞因子濃度依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，比較各組細(xì)胞因子濃度，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該IL-6和/或TNF-a細(xì)胞因子作為評價指標(biāo),反之,放棄。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(5)具體步驟包括培養(yǎng)板每孔加入步驟(I)中各組大鼠血清稀釋液100 iil，復(fù)孔，血清樣本用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG、HRP-羊抗大鼠IgE抗體作為二抗，四甲基聯(lián)苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值；血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算；比較各組總Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該Ig、IgG、IgE中的一種或幾種作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(6)具體步驟包括將步驟(I)中各組大鼠血液加入適量肝素鈉，制備血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然溫度下染色10分鐘-15分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢，記錄各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)； 比較各組各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該各類白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)作為評價指標(biāo)，反之，放棄。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(I)中，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙的時間為30天、60天、90天以及經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復(fù)期。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的篩選方法，其特征在于，步驟(I)中，所述卷煙包括焦油含量為8mg/支的低焦油卷煙和/或焦油含量為12mg/支或13mg/支的普通卷煙。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，所述的大鼠為SD大鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標(biāo)的篩選方法，包括步驟以吸空氣大鼠血清、脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為正常對照組，經(jīng)鼻連續(xù)抽吸卷煙大鼠血清脾淋巴細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹腔巨噬細(xì)胞及血液作為吸煙組；檢測各組淋巴細(xì)胞增殖能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬情況、IL-6、TNF-α、Ig、IgG、IgE含量和白細(xì)胞分類計數(shù)；最終篩選出淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)、IL-6、IgG、IgE含量、白細(xì)胞分類計數(shù)五個指標(biāo)作為敏感穩(wěn)定的評價指標(biāo)反應(yīng)吸煙大鼠免疫功能的變化。該方法科學(xué)全面，篩選出的評價指標(biāo)具有良好的敏感穩(wěn)定性。
文檔編號G01N33/00GK102735804SQ20121025486
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者儲國海, 周國俊, 王琴美, 胡瑗, 黃芳芳 申請人:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司