專利名稱：一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒。
背景技術：
白血病是以造血細胞分化阻滯為特征的一類惡性疾病，目前根據(jù)累及的細胞類別不同分為淋巴細胞白血病、髓系白血病、紅白血病及巨核細胞白血病等。其中以急性髓系白血病(AML)因髓系細胞分化阻滯階段不同而呈現(xiàn)很大的異質性。傳統(tǒng)的對AML的FAB分型已經(jīng)不足以反映AML的特征，臨床應用有限。因此，目前廣泛運用的WHO的分型將AML的免疫標志物表達(免疫分型)、細胞遺傳學改變及分子生物學(融合基因、突變)等納入分類因素，更詳細的反映了 AML的真實特征及其與預后的關系，對臨床治療的指導意義更大。 雖然目前可用多種免疫標志物、分子標志物或遺傳學改變將不同臨床特點的AML亞型分別開來，但是仍有大部分AML尚無明確的分子標志物將其分別開來而被歸為未分型組，僅能參照FAB的分型粗略地將其劃分到大致的分化階段。尋找新的、更精確反映白血病分化階段的免疫標志物或分子標志物，研究其與臨床的關系將是深入認識不同亞型AML從而實現(xiàn)精密的個體化治療的前提。VSTMl (V-set and transmembrane domain containing I)是由北京大學人類疾病基因研究中心新發(fā)現(xiàn)的一種潛在的細胞因子編碼基因。人類VSTMl基因定位于染色體19ql3. 42，存在五種剪切體，其中VSTMl-vl和VSTMl_v2是兩種主要形式。VSTMl-vl為I型膜蛋白，在NK、T、B、單核和粒細胞中廣泛表達，在大多數(shù)腫瘤來源的細胞系中表達缺失；VSTM1-V2為經(jīng)典分泌的糖蛋白，能促進外周血⑶4+T細胞分泌IL-17A。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括流式細胞儀和用于檢測VSTMl蛋白的抗體組；所述VSTMl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組包括抗VSTMl抗體。上述試劑盒中，所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組還包括抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體。上述試劑盒中，所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組由抗VSTMl抗體、抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體。上述試劑盒中，所述抗VSTMl抗體、抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體均用不同熒光素標記；所述抗VSTMl抗體具體為VSTM1-FITC，所述抗CD45抗體具體為CD45-PerCP、所述抗CD33抗體具體為CD33-APC，所述抗CD34抗體具體為CD34-PE。
上述試劑盒中，所述試劑盒還包括記載在載體上的5種判斷標準I)若表達VSTMl的陽性細胞占幼稚細胞百分比為12. 40%和/或VSTMl蛋白平均熒光強度為12. 90，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為MO或Ml ；2)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為12. 71%和/或VSTMl平均熒光強度為33. 13，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M2 ；3)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為95. 26%和/或VSTMl平均熒光強度為106. 28，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M3 ；4)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為18. 59%和/或VSTMl平均熒光強度為33. 68，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M4 ； 5)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為47. 35%和/或VSTMl平均熒光強度為120. 23，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M5。上述試劑盒中，所述髓系白血病細胞為急性髓系白血病細胞。上述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的產(chǎn)品中的應用。上述應用中，所述試劑盒由所述流式細胞儀、所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組和所述記載在載體上的5種判斷標準組成；所述髓系白血病細胞為急性髓系白血病細胞。上述急性髓系白血病細胞分化階段為如下5種分化階段的任意一種1)M0或Ml ；2) M2 ；3)M3 ；4)M4 ;5)M5。上述應用為將待測髓系白血病細胞用上述試劑盒進行檢測，I)若表達VSTMl的陽性細胞占幼稚細胞百分比為12. 40%和/或VSTMl蛋白平均熒光強度為12. 90，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為MO或Ml ；2)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為12. 71%和/或VSTMl平均熒光強度為33. 13，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M2 ；3)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為95. 26%和/或VSTMl平均熒光強度為106. 28，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M3 ；4)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為18. 59%和/或VSTMl平均熒光強度為33. 68，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M4 ；5)若表達VSTMl陽性細胞占幼稚細胞百分比為47. 35%和/或VSTMl平均熒光強度為120. 23，則所述髓系白血病細胞的分化階段為或候選為M5。上述VSTMl蛋白在開發(fā)、設計和/或制備檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述髓系白血病細胞具體為急性髓系白血病細胞；所述急性髓系白血病細胞分化階段具體為如下5種分化階段中的任一一種1)M0或Ml ；2)M2 ；3)M3 ；4)M4 ;5)M5。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 VSTMl蛋白的表達與髓系細胞的分化有關，因此得到了一種檢測急性髓系白血病髓系細胞分化階段的試劑盒，利用該試劑盒檢測VSTMl蛋白的表達，從而判斷出急性髓系白血病髓系細胞的不同分化階段，更詳細和及早的反應AML的分化過程，對臨床治療的指導意義更大。


圖I為VSTMl在正常供者骨髓各細胞亞群中的表達示例2為VSTMl在正常供者不同分化階段的髓系細胞中的表達示例3為VSTMl在正常供者不同分化階段的髓系細胞中的表達示例4為VSTMl在正常供者不同分化階段的髓系細胞中的表達水平圖5為VSTMl在白血病骨髓細胞中的表達示例6為VSTMl在不同亞型AML中的表達示例7為AML急性髓系白血病骨髓細胞中VSTMl的表達圖8為VSTMl在M5中的表達與⑶34表達水平有關圖9為ATRA誘導分化后NB4細胞VSTMl的表達和⑶I Ib的表達 圖10為K562細胞ATRA誘導后VSTMl的表達圖11為APL細胞經(jīng)ATRA處理后VSTMl的mRNA和蛋白的表達
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，部分具體列如下I、小牛血清、RPMI1640 :購自GIBCO公司。2、TRIzol 試劑購自 Invitrogen 公司3、隨機引物、M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司。4、急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4 (NB4細胞購自北京欣興唐生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為CL007 ；)。6、6孔、24孔及96孔培養(yǎng)板購自Corning公司。7、熒光素標記的單克隆抗體CD45-PerCP(產(chǎn)品目錄號347464)、CD33-APC(產(chǎn)品目錄號340474)、CD13-APC (產(chǎn)品目錄號557454)、CD34-PE (產(chǎn)品目錄號348057)CD34-PE-Cy7(產(chǎn)品目錄號:348057)、CD117-PE (產(chǎn)品目錄號:340529)、CD16_APC_Cy7 (產(chǎn)品目錄號557758)、CD14-APC-Cy7(產(chǎn)品目錄號333951)及CDllb-PE(產(chǎn)品目錄號:333142),均購自美國 Becton Dickinson 公司。8、多克隆抗體VSTM1-FITC :將抗原多肽免疫兔，收集兔血清，純化并且熒光標記得到多克隆抗體VSTM1-FITC，抗原多肽為VSTMl蛋白，其氨基酸序列為序列表中的序列I :9、全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA),三氧化二砷(As2O3):購自Sigma-Aldrich 公司。下述實施例中所用的主要儀器設備如下I、超凈工作臺北京半導體設備廠；2、CO2培養(yǎng)箱美國NAPCO牌；3、低溫高速離心機GS_15R型,美國Beckman公司；4、流式細胞儀FACSort 型，美國 Becton Dickinson 公司；5、倒置光學顯微鏡日本Olympus公司；6、PCR 擴增儀美國 Perkin Elmer Cetus 公司，GeneAmp PCR System 9700 ；7、定量 PCR 儀美國 Perkin Elmer Cetus 公司，ABI7500 ；
8、低速離心機BFX5_320型(白洋離心機廠)；9、紫外分光光度計美國Nano Drop ND-IOOO0下述實施例中采用的細胞培養(yǎng)如下NB4及急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocytic leukemia, APL)病人骨髓細胞用 10%FBS/RPMI1640 (4. 5g/L glucose, 4mML-glutamine, lOOU/ml青霉素，lOOug/ml鏈霉素)培養(yǎng)，細胞復蘇及傳代按照常規(guī)進行。下述實施例中的VSTMl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。下述實施例中病人標本采集正常供者及白血病病人的骨髓細胞采自在北京人民醫(yī)院就診的病人，患者知情，且本研究獲得北京大學人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，遵循赫爾辛基宣言；標本用肝素抗凝；而且所有細胞的FAB分型已經(jīng)確定。

下述實施例中的VSTMl蛋白的表達采用流式細胞檢測，運用帶不同熒光素的抗白細胞表面抗原的抗體標記骨髓細胞，具體步驟如下(I)骨髓細胞計數(shù)取IOul樣本，加適量冰醋酸裂解紅細胞并稀釋血細胞，顯微鏡下計數(shù)；(2)按照抗體說明書加適量抗體至200 ill血樣，室溫(25 °C)避光孵育15min ；(3)加紅細胞裂解液(NH4CL I. 8675g, Tris 0. 65g蒸餾水250ml)，室溫裂解8min ；(4)離心 1200rpmX IOmin,棄上清液；(5)加磷酸緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)(購自上海耕欣生物科技有限公司)洗兩遍；(6)離心1200rpmX10min，棄上清液，加200 上流式細胞儀檢測。(7)數(shù)據(jù)分析,運用FCS Express V3軟件分析流式細胞術檢測數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析在SPSS軟件17. 0中進行。下述實施例中的經(jīng)不同濃度ATRA誘導分化后不同時間點的NB4細胞VSTMl表達水平與CDllb表達水平的相關性采用Pearson相關系數(shù)分析。P值小于0. 05定義為有統(tǒng)計
學差異。實施例I、不同髓系細胞中的VSTMl表達分析一、檢測正常骨髓細胞分化階段中的VSTMl表達UVSTMl在正常骨髓各細胞亞群中的表達為明確VSTMl蛋白在骨髓各亞群細胞中的表達水平，運用不同熒光素標記的抗白細胞表面抗原的抗體及抗VSTMl抗體標記骨髓細胞，運用流式細胞儀檢測了 VSTMl在29例正常供者骨髓細胞亞群中的表達。運用⑶45與側向散色光(SSC)將細胞分為淋巴細胞(⑶45++且SSC小)，幼稚細胞(CD45+且SSC小)，成熟粒細胞(CD45+且SSC大)及單核細胞(CD45++且SSC小)。采用上述的流式細胞檢測29例正常供者骨髓細胞亞群中VSTMl的表達，抗體為VSTM1-FITC, CD45-PerCP。實驗重復三次，結果取平均值。在正常供者骨髓中，VSTMl陽性細胞占淋巴細胞的百分比為15. 54%，平均熒光強度為23. 33 ;占成熟粒細胞的百分比為94. 01%，平均熒光強度為167. 61 ;占幼稚細胞的百分比為37. 14%，平均熒光強度為46. 70。圖I是其中一例的示意圖。VSTMl在成熟粒細胞中的表達很高，而在幼稚細胞中表達很低，說明VSTMl在不同分化階段的髓系細胞中的表達明顯不同，VSTMl可能與髓系細胞的分化有關。各群間VSTMl的陽性百分比及平均熒光強度均具有統(tǒng)計學意義(P值均為0. 000)。2、VSTMl在正常髓系細胞不同分化階段的表達為明確VSTMl在正常髓系細胞不同分化階段的表達水平，進一步運用六種熒光素組合的單克隆抗體標記骨髓細胞，運用流式細胞儀分別檢測不同階段正常髓系細胞VSTMl的表達水平。每例供者做兩管，共檢測了 11例正常供者骨髓樣本。運用⑶45和側向散色光(SSC)將細胞初步分為淋巴細胞(R2)、幼稚細胞(R3)，成熟粒細胞(R5)及單核細胞(R4)。再按照⑶34、⑶117、⑶33、⑶13、⑶16、CD14的表達水平將R3髓系細胞各依其成熟度分為原始細胞(⑶34+)，早幼粒細胞(⑶34-⑶117+⑶16-)，中幼粒細胞(⑶34-⑶117-⑶16-⑶13+)，晚幼粒細胞(⑶16+);將R5中的單核細胞分為未成熟髓系細胞(CD14-)和成熟單核細胞(CD14+)(圖2-3)。采用上述的流式細胞檢測，抗體組合分別如下管I VSTMl-FITC/CD117-PE/CD45-PerCP/CD13-APC/CD34-PE-Cy7/ CD16-APC-Cy7 ；管2:VSTMl-FITC/CD117-PE/CD45-PerCP/CD33-APC/CD34-PE-Cy7/CD14-APC-Cy7。結果如表I和圖4所示，表明VSTMl在原始細胞，早幼粒細胞，中幼粒細胞和晚幼粒細胞中表達的陽性百分比逐漸升高(表1，圖4，P = 0.000)。而且，在整個粒細胞群中，VSTMl的表達強度隨⑶16表達強度的升高而增強(圖4，相鄰分化階段細胞之間VSTMl表達強度比較，P值均為0.005)。在R4中，⑶14+成熟單核細胞的VSTMl陽性百分比明顯高于CD 14-細胞(68. 66 vs 34. 35，P = O. 004)。表I為VSTMl在正常供者不同分化階段的髓系細胞中的表達
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒，包括流式細胞儀和用于檢測VSTMl蛋白的抗體組；所述VSTMl蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列I ;所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組包括抗VSTMl抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的試劑盒，其特征在于 所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組還包括抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于 所述用于檢測VSTMl蛋白的抗體組由抗VSTMl抗體、抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于 所述抗VSTMl抗體、抗⑶45抗體、抗⑶33抗體和抗⑶34抗體均用不同熒光素標記。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于 所述抗VSTMl抗體為VSTM1-FITC，所述抗CD45抗體為CD45_PerCP、所述抗CD33抗體為CD33-APC，所述抗CD34抗體為CD34-PE。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述髓系白血病細胞為急性髓系白血病細胞。
7.權利要求1-6中任一所述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的產(chǎn)品中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述髓系白血病細胞為急性髓系白血病細胞。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述急性髓系白血病細胞分化階段為如下5種分化階段中的任——種1)M0或Ml ；2)M2 ；3)M3 ；4)M4 ;5)M5。
10.所述VSTMl蛋白在開發(fā)、設計和/或制備檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的產(chǎn)品中的應用；所述髓系白血病細胞具體為急性髓系白血病細胞；所述急性髓系白血病細胞分化階段具體為如下5種分化階段中的任——種1)M0或Ml ；2)M2 ；3)M3 ；4)M4 ；5)M5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測或輔助檢測髓系白血病細胞分化階段的試劑盒，包括用于檢測VSTM1蛋白表達的裝置和用于檢測VSTM1蛋白表達試劑；所述VSTM1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了VSTM1蛋白的表達與髓系細胞的分化有關，因此得到了一種檢測急性髓系白血病髓系細胞分化階段的試劑盒，利用該試劑盒檢測VSTM1蛋白表達的表達量，從而判斷出急性髓系白血病髓系細胞的不同分化階段，更詳細和及早的反應急性髓系白血病的分化過程，將在白血病的診治中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/68GK102768283SQ20121025695
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權日2012年7月23日
發(fā)明者冷馨, 劉艷榮, 李婷, 王緒華, 謝敏, 阮國瑞, 陳珊珊, 韓文玲, 馬大龍, 黃曉軍 申請人:北京大學人民醫(yī)院