血漿中5種黃酮苷的分析方法及其在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)血漿樣本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷的方法，包括步驟(1)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)。本發(fā)明的分析方法具有良好的專屬性、精密度和準(zhǔn)確度較高，線性范圍較寬，可用于中藥組合物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。
【專利說(shuō)明】血漿中5種黃酮苷的分析方法及其在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于現(xiàn)代中藥應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及血漿中5種黃酮苷的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，以及在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)譜是以分子量測(cè)定為基礎(chǔ)的分析方法，近年來(lái)，其與高效液相色譜法(HPLC)或毛細(xì)管電泳法(CE)等分離機(jī)制的聯(lián)用不僅提高了其抗雜質(zhì)干擾的能力和節(jié)省了分析時(shí)間，而且大大提高了測(cè)定的靈敏度。軟電離技術(shù)，如電噴霧離子化技術(shù)(ESI)的發(fā)展，則擴(kuò)大了分子量檢測(cè)的范圍。此外，電噴霧離子化技術(shù)可在大氣壓下進(jìn)行，方便與液相色譜儀連結(jié)，使液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)成為了一種高靈敏度、高選擇性且快速分析的技術(shù)，其能在短時(shí)間之內(nèi)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)分析物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS/MS)能更清楚地了解藥物在動(dòng)物活體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)規(guī)律，從而讓研究人員能夠更好地掌握藥物的藥理作用。另外還可以省去復(fù)雜、繁瑣且耗時(shí)的樣本前處理工作。
[0003]糖敏靈丸是在臨床驗(yàn)證的有效方開(kāi)郁清胃顆?；A(chǔ)上加減變化與劑型改革而成。糖敏靈丸由黃連、大黃、黃芩、白芍、柴胡、枳實(shí)、山楂、烏梅、半夏、天花粉共十味常用中藥組成，具有開(kāi)郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁之功效。臨床觀察證實(shí)其對(duì)II型糖尿病的血糖有明顯的改善作用，尤其是對(duì)體型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加顯著。同時(shí)，藥理實(shí)驗(yàn)揭示糖敏靈能顯著增強(qiáng)高熱量飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型糖尿病大鼠和自發(fā)性II型糖尿病大鼠的胰島素敏感性。
[0004]柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷是糖敏靈中的5種有效成份，但是目前還沒(méi)有可以同時(shí)檢測(cè)血漿樣本中這5種成份的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]糖敏靈制劑作為藥物，需要進(jìn)行必要的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，由于上述藥物活性成分在血中含量極低，需要精密儀器和精密方法進(jìn)行操作，本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究，找到了適合測(cè)定這些物質(zhì)的方法。
[0006]本發(fā)明提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)血漿樣本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷的方法，以及在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
[0007]根據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)方法包括步驟(I)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)，其特征在于步驟
(I)樣品制備采用包括以下步驟的方法:
[0008]a.向待測(cè)樣品中依次加入所述流動(dòng)相、內(nèi)標(biāo)溶液，酸及水并混勻；
[0009]b.上C18固相萃取柱，先用水洗脫,再用低級(jí)醇洗脫；
[0010]c.收集醇洗脫液，并吹干；
[0011]d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液測(cè)定。
[0012]試驗(yàn)表明，步驟(l)b中使用固相萃取法(SPE)，回收率高且操作簡(jiǎn)單。比較了液液萃取法和固相萃取法(SPE)，結(jié)果表明，SPE法處理的樣品內(nèi)源性物質(zhì)少，操作步驟少，待測(cè)物提取回收率均高于77%。黃酮苷極性較大，試驗(yàn)結(jié)果確定其更適合用SPE法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理。[0013]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟a中所述內(nèi)標(biāo)為甘草苷。
[0014]對(duì)桅子苷、柴胡皂苷A、大豆苷和甘草苷進(jìn)行了篩選，其中甘草苷與5個(gè)待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似，均屬于黃酮苷類化合物，以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度相當(dāng)，可以提高方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
[0015]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，其中步驟a所述的酸性物質(zhì)包括但不限于鹽酸、硫酸、高氯酸，磷酸，甲酸，乙酸等。
[0016]優(yōu)選的，步驟a中所述酸性物質(zhì)為鹽酸。
[0017]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟b中所述醇為甲醇。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
[0019]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟(2)檢測(cè)所用液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為0.01%-0.5%甲酸水-乙臆。
[0020]優(yōu)選的，步驟⑵檢測(cè)所用流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈，體積比為30:70，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?
[0021]0^3.0min, 24%B ；
[0022]3.0~3.Imin，24%Β_40%Β ；
[0023]3.1~10.0min，40%B_60%B。
[0024]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟(2)檢測(cè)所用質(zhì)譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正、負(fù)離子切換模式。
[0025]優(yōu)選的，負(fù)離子模式下，參數(shù)噴霧電壓為3500V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為35eV，35eV，35eV，12eV ;正離子模式下，參數(shù)噴霧電壓為4000V，黃芩苷和漢黃芩苷的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為28eV，21eV。
[0026]分別比較了 ESI源正、負(fù)離子兩種掃描模式，結(jié)果表明柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和甘草苷(IS)在負(fù)離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度高于正離子模式，而黃芩苷和漢黃芩苷在正離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)更好。因此優(yōu)選正負(fù)離子切換模式，0-4.0min時(shí)，在負(fù)離子模式下掃描；
4.1-10.0min時(shí)，在正離子模式下掃描。
[0027]本發(fā)明所述方法可成功用于糖敏靈制劑藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。
[0028]本發(fā)明所述糖敏靈丸由下列重量份的原料制成:
[0029]天花粉10~30份柴胡10~30份枳實(shí)3~15份大黃I~6份半夏1~12份黃芩3~15份黃連I~12份白芍3~15份烏梅5~20份山楂3~15份。
[0030]制備方法如下:所述的黃芩加水提取兩次，每次I小時(shí)，提取液加濃鹽酸調(diào)Ph值至
1.5~2.0，80°C保溫I小時(shí)，抽濾，濾餅干燥，得黃芩提取物；所述的黃連加75%乙醇提取2次每次2小時(shí)，提取液減壓回收乙醇，加入濃鹽酸調(diào)ph值至1.0~2.0，抽濾，濾餅干燥，得黃連提取物；其余8味藥用水回流提取2次，每次I小時(shí)，提取液減壓濃縮至1: 1，加入95%乙醇至含醇量70%，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至稠膏加入黃連提取物與黃芩提取物，即得糖敏靈制劑的藥物活性成分。藥物活性成分與微晶纖維素按適當(dāng)比例混合，按照常規(guī)方法制備成濃縮丸。
[0031]本發(fā)明所述糖敏靈制劑包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉針劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)?、滴劑、貼劑、滴丸。因?yàn)樗幬锘钚猿煞窒嗤员景l(fā)明提供的方法可以用于多種不同制劑的糖敏靈藥代動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)。
[0032]本申請(qǐng)相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而言所具有的優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0033]1、可以一次性檢測(cè)多種藥物活性成分的數(shù)據(jù)。
[0034]2、可用于多種藥物活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。
[0035]3、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。
[0036]本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1.空白血漿樣品中甘草苷(IS)的SRM色譜圖。
[0038]圖2.空白血漿中加入甘草苷(IS)對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0039]圖3.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中甘草苷(IS)的SRM色譜圖。
[0040]圖4.空白血漿樣品中柚皮苷的SRM色譜圖。
[0041]圖5.空白血漿中加入柚皮苷對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0042]圖6.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中柚皮苷的SRM色譜圖。
[0043]圖7.空白血漿樣品中橙皮苷和新橙皮苷的SRM色譜圖。
[0044]圖8.空白血漿中加入橙皮苷和新橙皮苷對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0045]圖9.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中橙皮苷和新橙皮苷的SRM色譜圖。
[0046]圖10.空白血漿樣品中黃芩苷的SRM色譜圖。
[0047]圖11.空白血漿中加入黃芩苷對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0048]圖12.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中黃芩苷的SRM色譜圖。
[0049]圖13.空白血漿樣品中漢黃芩苷的SRM色譜圖。
[0050]圖14.空白血漿中加入漢黃芩苷對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0051]圖15.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中漢黃芩苷的SRM色譜圖。
[0052]圖16.大鼠灌胃給予糖敏靈后，柚皮苷的藥-時(shí)曲線。
[0053]圖17.大鼠灌胃給予糖敏靈后，橙皮苷的藥-時(shí)曲線。
[0054]圖18.大鼠灌胃給予糖敏靈后，新橙皮苷的藥-時(shí)曲線。
[0055]圖19.大鼠灌胃給予糖敏靈后，黃芩苷的藥-時(shí)曲線。
[0056]圖20.大鼠灌胃給予糖敏靈后，漢黃芩苷的藥-時(shí)曲線。
[0057]圖21.甘草苷(IS) [Μ-Η]-離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0058]圖22.柚皮苷[M - H]_離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0059]圖23.橙皮苷[Μ-Η]-離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0060]圖24.新橙皮苷[Μ-Η]-離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0061]圖25.黃芩苷[M+H]+離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0062]圖26.漢黃芩苷(IS) [M+H]+離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】:[0063]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0064]本發(fā)明所述的取動(dòng)物灌胃糖敏靈后抽取的血漿，是使用糖敏靈丸作為藥物，給動(dòng)物服用，當(dāng)然也包括給人服用，服用后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的藥物吸收，通過(guò)動(dòng)脈或靜脈用注射器抽取血液，分離出血漿并用肝素等抗凝劑抗凝，然后經(jīng)過(guò)血漿預(yù)處理，再用儀器測(cè)定血漿中的藥物活性成分的含量。
[0065] 本發(fā)明篩選方法如下:
[0066]試驗(yàn)例I血漿樣品中5種黃酮苷分析方法的建立
[0067]LC-MS/MS 條件
[0068]色譜柱:ZORBAXSB-C18(150X 2.1mm, 5 μ m, Agilent)
[0069]預(yù)柱-Security Guard-C18 (4.0mmX 3.0mm 1.d, 5 μ m, Phenomenex)
[0070]流動(dòng)相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序:0~3.0min，24%Β ；3.0~3.Imin，24%Β - 40%Β ；3.1-10.0min, 40%Β - 60%Β。
[0071]柱溫:25°C
[0072]流速:300μ L.mirf1
[0073]離子源:電噴霧離子化源(ESI)
[0074]電離模式:正、負(fù)離子切換模式
[0075]MS/MS:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。0-4.0min，采用負(fù)離子模式，用于定量分析的離子分別為m/z579 — 271 (柚皮苷)，m/z609 — 301 (橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417 — 255 (內(nèi)標(biāo)，甘草苷)；4.1-10.0min,采用正離子模式，用于定量分析的離子分別為m/z447 — 271 (黃芩苷)，m/z461 — 285 (漢黃芩苷)。
[0076]質(zhì)譜參數(shù):負(fù)離子模式下，參數(shù)噴霧電壓為4000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)電壓分別為35eV，35eV，35eV，12eV ;正離子模式下，參數(shù)噴霧電壓為3500V，黃芩苷和漢黃芩苷的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)電壓分別為28eV，21eV ;掃描時(shí)間:0.5s。正、負(fù)離子模式下，其它質(zhì)譜參數(shù)相同:離子源電壓為IOeV,毛細(xì)管溫度為350°C，鞘氣為N2 (45psi),輔助氣為N2 (15psi),碰撞氣體壓力為Arl.0mTorr0
[0077]溶液的制備
[0078](I)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷各適量，精密稱定，分別置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.172mg.mL ^0.105mg.mL S 0.126mg.mL S 0.68 Img.mL ^0.221mg.mL 1 的對(duì)照品溶液。分別精密量取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷對(duì)照品溶液0.3,0.1,0.8，2.0，0.4mL，置于同一 IOmL量瓶中，甲醇-水(I: I)稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為
5.160 μ g.mL 1,1.050 μ g.mL S 10.08 μ g.mL S 136.2 μ g.mL 1,8.84 μ g.mL 1 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。
[0079]分別精密量取適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用去離子水稀釋制成混合對(duì)照品溶液，其中柚皮苷濃度為 2.580，7.740，25.80，64.50，129.0, 258.0, 516.0ng.mL'橙皮苷濃度為 0.5250，1.575，5.250，13.12，26.25，52.50，105.0ng.mL' 新橙皮苷濃度為 5.040，15.12，50.4O, 126.0, 252.0, 504.0, 1008ng.mL-1,黃芩苷濃度為 68.10，204.3，681.0, 1703，3405，6810，I
?362Χ 104ng.mL'漢黃芩苷濃度為 4.420，13.26，44.20，110.5，221.0, 442.0, 884ng.mL'
[0080](2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制取甘草苷適量，精密稱定，置IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，獲得濃度為0.206mg.mL—1的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液0.2mL,置于IOOmL量瓶中，去離子水稀釋至刻度，獲得濃度為412.0ng.mL—1的內(nèi)標(biāo)溶液。
[0081 ] 各儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。[0082]血漿樣品預(yù)處理[0083]取肝素抗凝血漿100 μ L，置2.0mL塑料EP管中，依次加入流動(dòng)相100 μ L，內(nèi)標(biāo)溶液100 μ L(甘草苷溶液，412.0ng.mL—1)，0.6M鹽酸溶液50 μ L，加去離子水600 μ L，渦旋30s混勻后，上處理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去離子水平衡)，先用1.0mL去離子水洗脫，然后用LOmL甲醇洗脫。甲醇洗脫液于45°C氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μ L乙腈-TK (3:7)溶解，120001'*11^11-1離心51^11，取上清液2(^1^進(jìn)樣，記錄色譜圖。
[0084]分析方法的確證
[0085](I)方法的專屬性大鼠空白血漿100 μ L，除用100 μ L流動(dòng)相代替內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作，得空白樣品的色譜圖(圖1、4、7、10和13);將一定濃度的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依法操作，得相應(yīng)的色譜圖(圖2、5、8、11和14)，取大鼠灌胃糖敏靈后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖(圖3、6、9、12和15)。其中甘草苷(IS)、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷的保留時(shí)間分別為2.0，2.3，2.5，2.8，4.1，8.3min ;結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。
[0086](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍取大鼠空白血漿IOOyL,加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μ L，配制成相當(dāng)于柚皮苷血漿質(zhì)量濃度為2.580，7.740，25.80，64.50，129.0, 258.0，516.0ng.mL—1的模擬血漿樣品，橙皮苷血漿質(zhì)量濃度為0.5250，1.575,5.250，13.12，26.25，52.50，105.0ng.mL-1 的模擬血漿樣品，新橙皮苷 5.040，15.12，50.40，126.0, 252.0,504.0，1008ng.mL—1的模擬血漿樣品，黃芩苷血漿質(zhì)量濃度為為68.10，204.3,681.0,1703，3405，6810，1.362 XlO4ng.mL—1的模擬血漿樣品，漢黃芩苷血漿質(zhì)量濃度為4.420，
13.26,44.20,110.5,221.0,442.0，884ng.mL-1 的模擬血漿樣品，除不加 100 μ L 流動(dòng)相外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=l/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸分析。典型大鼠血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線為柚皮苷:y=5.542X IO^4X-4.717X10_4，r=0.9956 ；橙皮苷:y=l.440 X 10-3χ - 4.465 X 1(T4，r=0.9952 ;新橙皮苷:y=l.909X 10_3x - 6.645X 10_3, r=0.9951 ;黃芩苷:y=l.283x - 1.684X 10_2, r=0.9961 ；漢黃芩苷:y=2.159Χ10_3χ-3.142X10—3，r=0.9959。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃岑昔定量下限(LLOQ)分別為 0.5160ng.mL \ 0.5250ng.mL \ 0.5040ng.mL S0.3400ng.mL \ 0.3680ng.ml,、
[0087](3)精密度和準(zhǔn)確度取大鼠空白血漿100 μ L，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法，分別配制低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)量控制(QC)樣品。每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3天，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，結(jié)果進(jìn)行方差分析，求得方法的精密度RSD和準(zhǔn)確度RE，各被測(cè)組分的日間RSD ( 11%，日內(nèi)RSD < 9.9%RE在-5.1%~6.7%之間，結(jié)果見(jiàn)表1。分析方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則對(duì)生物樣品分析方法技術(shù)要求，該法可用于大鼠血漿中5種黃酮苷成分準(zhǔn)確測(cè)定。
[0088](4)提取回收率取空白血漿100 μ L，按上述“精密度和準(zhǔn)確度”項(xiàng)下方法分別制備低、中、高三個(gè)濃度的QC樣品，各6樣本，照“血漿樣品的預(yù)處理”方法操作，峰面積為A ;同時(shí)另取大鼠空白血漿IOOyL,按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作，向獲得的上清液中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μ L和內(nèi)標(biāo)100 μ L，渦流混合，45°C下氮?dú)獯蹈?，加?00 μ L流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)樣分析，色譜峰面積為B出次測(cè)定的平均值)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值(Α/Β)計(jì)算提取回收率，采用同樣的方法考察了內(nèi)標(biāo)的提取回收率。測(cè)得各待測(cè)組分的提取回收率均大于77%，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0089](5)基質(zhì)效應(yīng)采用不同來(lái)源的空白血漿進(jìn)行6樣本分析，取大鼠空白血漿100 μ L，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，向獲得的上清液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液(含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷分別

為64.50，13.12 126.0,1703，110.5ng.mL—1)和內(nèi)標(biāo)溶液(412.0ng.1)各100 μ L，45°C下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μ L流動(dòng)相復(fù)溶，12000r.mirT1離心5min，取上清液20 μ L進(jìn)樣分析，峰面積為B ;同時(shí)取相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μ L進(jìn)樣分析，峰面積為C。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值(B/C)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3。
[0090](6)樣品穩(wěn)定性考察了未處理的血漿樣品室溫放置4h的穩(wěn)定性，血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性，處理后的血漿樣品室溫放24h內(nèi)的穩(wěn)定性。每一項(xiàng)穩(wěn)定性考察時(shí)，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍”項(xiàng)下配制低、中、高三個(gè)濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，照“血漿樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，測(cè)得樣品濃度，計(jì)算相對(duì)誤差(RE%)，結(jié)果見(jiàn)表
4。結(jié)果表明處理后的血漿樣品室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定(RE在±6.2%, RSD ( 14%)，未處理的血漿樣品室溫放置4h穩(wěn)定(RE在±11%，RSD ( 14%)，血漿樣品經(jīng)歷3次凍-融循環(huán)后穩(wěn)定(RE 在 ±6.1%，RSD ( 13%)。
[0091]討論
[0092]采用正、負(fù)離子切換掃描模式，建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中5種黃酮苷的LC-MS/MS方法，該方法專屬性好、靈敏度高，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷





和漢黃芩

苷的LLOQ












分別



為 0.5160ng.mL \ 0.5250ng.mL \ 0.5040ng.mL \ 0.3400ng.mL S 0.3680ng.mL、
[0093]內(nèi)標(biāo)的選擇
[0094]對(duì)桅子苷、柴胡皂苷A、大豆苷和甘草苷進(jìn)行了篩選，其中甘草苷與5個(gè)待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似，均屬于黃酮苷類化合物，以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度相當(dāng)，可以提高方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
[0095]血漿樣品預(yù)處理方法的建立
[0096]為了獲得雜質(zhì)少、提取回收率高且操作簡(jiǎn)單的血漿樣品預(yù)處理方法，對(duì)液液萃取法和固相萃取法(SPE)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，SPE法處理的樣品內(nèi)源性物質(zhì)少，操作步驟少，待測(cè)物提取回收率均高于77%。黃酮苷極性較大，試驗(yàn)結(jié)果確定其更適合用SPE法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理。
[0097]質(zhì)譜條件的優(yōu)化
[0098]分別比較了 ESI源正、負(fù)離子兩種掃描模式，結(jié)果表明柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和甘草苷(IS)在負(fù)離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度高于正離子模式，而黃芩苷和漢黃芩苷在正離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)更好。因此選擇掃描切換
模式，0-4.0min時(shí)，在負(fù)離子模式下掃描；4.ΙΟ.0min時(shí)，在正離子模式下掃描。取一定濃度的待測(cè)成分對(duì)照品溶液進(jìn)行一級(jí)全掃描分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下柚皮苷的準(zhǔn)分子離子為m/z579 [Μ - H],橙皮苷的準(zhǔn)分子離子為πι/Ζ609[Μ-Η，新橙皮苷的準(zhǔn)分子離子為πι/Ζ609[Μ-Η，甘草苷(IS)的準(zhǔn)分子離子為m/z417[M - H]_ ;正離子模式下黃芩苷的準(zhǔn)分子離子為m/z447[M+H]+，漢黃芩苷的準(zhǔn)分子離子為 m/z461 [M+H] +。
[0099]待測(cè)成分均為黃酮苷類化合物，裂解方式相似，即離子化過(guò)程中易丟失其配糖基形成產(chǎn)物離子。在負(fù)離子模式下對(duì)柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷(is)的準(zhǔn)分子離子m/z579，m/z609，m/z609，m/z417進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(如圖21-圖24所示)。其中，柚皮苷的主要碎片離子m/z271是其準(zhǔn)分子離子m/z579丟失一分子新橙皮糖而形成，橙皮苷的主要碎片離子m/z301是其準(zhǔn)分子離子m/z609丟失一分子蕓香糖而形成，新橙皮苷的主要碎片離子m/z301是其準(zhǔn)分子離子m/z609丟失一分子新橙皮糖而形成，甘草苷的主要碎片離子m/z255是其準(zhǔn)分子離子m/z417丟失一分子葡萄糖而形成的。在正離子模式下對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的準(zhǔn)分子離子m/z447和m/z461進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(如圖25和26所示)。黃芩苷和漢黃岑苷的主要碎片離子m/z271和m/z285,分別是其準(zhǔn)分子離子m/z447和m/z461丟失一分子葡萄糖醛酸苷而形成的。圖21-圖26表明，m/z271 (柚皮苷),m/z301 (橙皮苷)，m/z301 (新橙皮苷)，m/z255 (IS)，m/z271 (黃芩苷)，m/z285 (漢黃芩苷)響應(yīng)強(qiáng)且穩(wěn)定，因此作為SRM的定量碎片離子。
[0100]對(duì)碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)電壓和碰撞氣體能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)電壓分別為35eV，35eV, 35eV,12eV,28eV,21eV。
[0101]試驗(yàn)例2灌胃給藥大鼠糖敏靈后5種黃酮苷的藥動(dòng)學(xué)
[0102]血漿樣品的采集
[0103]取雄性Wistar大鼠8只，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。按8mL.kg—1 (相當(dāng)于柚皮苷 175mg.kg' 橙皮苷 23.2mg.kg-1,新橙皮苷 185mg.kg-1,黃芩苷 87.0mg.kg4，漢黃岑苷6.96mg.kg—1)劑量灌胃給予糖敏靈丸生理鹽水混懸液后，于Omin和給藥后0.1,0.2，0.3,0.7,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,24.0,32.0h 眼眶采血 0.3mL,置預(yù)先肝素化試管中，離心(4000rpm) IOmin,分取血漿，置20°C冰箱中保存待測(cè)。
[0104]藥動(dòng)學(xué)測(cè)定結(jié)果
[0105]Wistar大鼠灌胃給予糖敏靈(5.85g.kg—1)后，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷的平均藥物濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)表5和圖16-20。采用TOPFIT軟件，選用非隔室模型對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表6。
[0106]大鼠灌胃糖敏靈后的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)
[0107]灌胃給藥大鼠糖敏靈后5種黃酮苷的藥物動(dòng)力學(xué)行為。結(jié)果表明，大鼠灌胃給予糖敏靈后，5種黃酮苷藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均符合二室開(kāi)放模型；柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的藥時(shí)曲線趨勢(shì)一致，大鼠體內(nèi)迅速達(dá)峰，之后血藥濃度快速下降，在IOh時(shí)血藥濃度呈現(xiàn)微弱的回升，提示柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在大鼠體內(nèi)存在微弱的肝腸循環(huán)。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在腸內(nèi)菌群作用下脫糖基化生成苷元被吸收，其中大部分苷元與葡萄糖醛酸結(jié)合，因此血漿中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量較低。本研究中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷給藥劑量分別為175mg.kg-1, 23.2mg.kg' 185mg.kg'而其Cmax和AUCc^00值明顯很低,可能與上述原因有關(guān)，也可能是由于糖敏靈制劑中其他成分抑制柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的吸收，或加速其轉(zhuǎn)化成為苷元。
[0108]黃芩苷和漢黃芩苷的藥時(shí)曲線趨勢(shì)一致，在大鼠體內(nèi)都呈現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，黃芩苷和漢黃芩苷的Tmax均為l(T30min，出現(xiàn)雙峰的時(shí)間均為6~8h。由T1/2可知，黃芩苷的口服消除速率比漢黃芩苷快。黃芩苷和漢黃芩苷極性較大，很難直接吸收入血，其在腸道菌群葡萄糖醛酸酶作用下水解成為苷元黃芩素和漢黃芩素，苷元一部分在小腸粘膜UDPG-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶作用下重新轉(zhuǎn)化為糖苷被吸收入血，一部分被粘膜細(xì)胞中MRP2蛋白排到腸腔，還有一部分苷元吸收入血后被肝微粒體轉(zhuǎn)化為糖苷或其他代謝物。在一定范圍內(nèi)PH值越低，黃芩苷吸收越好，黃芩苷IOlOmin時(shí)出現(xiàn)吸收峰提示在胃或十二指腸上部吸收，可能與PH值有關(guān)；在6~8h時(shí)出現(xiàn)雙峰，提示在結(jié)腸部位受腸道菌群水解而被重新吸收，存在肝腸循環(huán)。
[0109]表1方法精密度與準(zhǔn)確度
【權(quán)利要求】
1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)血漿樣本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷的方法，包括步驟(1)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)，其特征在于步驟(1)樣品制備采用包括以下步驟的方法: a.向待測(cè)樣品中依次加入所述流動(dòng)相、內(nèi)標(biāo)溶液，酸及水并混勻； b.上C18固相萃取柱，先用水洗脫，再用低級(jí)醇洗脫； c.收集醇洗脫液,并吹干； d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液測(cè)定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a 中所述內(nèi)標(biāo)為甘草苷。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述酸為鹽酸。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述低級(jí)醇為甲醇。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)檢測(cè)所用的液相色譜條件為:色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為0.01% -0.5%甲酸水-乙腈。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述流動(dòng)相為0.1 %甲酸水-乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?
O~3.0min, 24% B ；
3.0 ~3.1min, 24% B-40% B ；
3.1 ~10.0min, 40% B-60% B。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)檢測(cè)所用質(zhì)譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正、負(fù)離子切換模式。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于質(zhì)譜參數(shù)如下:負(fù)離子模式下，參數(shù)噴霧電壓為3500V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為35eV，35eV，35eV，12eV ;正離子模式下,參數(shù)噴霧電壓為4000V,黃岑苷和漢黃岑苷的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為 28eV,21eV0
10.如權(quán)利要求1至9任意一項(xiàng)在測(cè)定糖敏靈制劑藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/72GK103575820SQ201210272757
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月1日
【發(fā)明者】佟玲, 周水平, 朱永宏, 馬曉慧, 靳元鵬, 鄂秀輝 申請(qǐng)人:天士力制藥集團(tuán)股份有限公司