專利名稱：一種化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種檢測人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多階段的、復(fù)雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細胞與宿主之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，其機理尚不甚清楚。近年來關(guān)于新的血管生成與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究進展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移灶生長的必要條件，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)新血管生成的最重要的細胞因子。研究表明血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)在血管系統(tǒng)的發(fā)育分化中具有不可替代的作用(Ferrara et al. Endocr. Rev. 1997, 18:4-25)。VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結(jié)合形成，等電點為8. 5，有很強的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構(gòu)體，分別為 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高親和力結(jié)合位點僅位于血管內(nèi)皮細胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內(nèi)皮細胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力(Kendall et al. PNAS USA, 1993，90:10705-9)。VEGF是癌癥生長、轉(zhuǎn)移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤(即癌癥)疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻報道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當(dāng)腫瘤因化療或手術(shù)“臨床治愈”時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預(yù)后的指標。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定(chemiluminesent immunoassay, CLEIA)是免疫測定技術(shù)繼酶免技術(shù)、放免技術(shù)、突光免疫技術(shù)和時間分辨突光免疫技術(shù)之后發(fā)展的一項新興測定技術(shù)。其基本原理是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測樣本中的抗原或抗體，由于它既具有免疫反應(yīng)的高度特異性，又具有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，近年來已被國內(nèi)外臨床實驗室及科研單位，廣泛應(yīng)用于各種激素、特種蛋白及藥物的監(jiān)測和分析。該方法具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快捷、標記物穩(wěn)定、無污染、儀器簡單經(jīng)濟等有點。目前，用過氧化氫和辣根過氧化物酶(HRP)聯(lián)合催化魯米諾類化合物發(fā)光的化學(xué)發(fā)光免疫測定效果比較好，應(yīng)用比較廣泛
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的檢測試劑盒。該試劑盒結(jié)果準確穩(wěn)定、特異性強、靈敏度高、使用方便、便于推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述發(fā)光檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為
I.反應(yīng)板；2.酶結(jié)合物；3.標準品；4.樣品稀釋液；5.濃縮洗滌液；6.發(fā)光底物Α、Β;7·封板膠紙。本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
Ca)以發(fā)光反應(yīng)板為固體支持物，將VEGF單克隆抗體包被于固體支持物上；
(b)用封閉液封閉；
(c)將生物標本與固定于發(fā)光板上的VEGF單克隆抗體接觸和保溫，生物標本中的VEGF特異地與VEGF單克隆抗體結(jié)合；
Cd)從VEGF單克隆抗體上分離生物標本；
(e)用辣根過氧化物酶(HRP)標記的VEGF多克隆抗體檢測VEGF，所用的發(fā)光底物為魯米諾溶液。本發(fā)明試劑盒的獨特性在于，它使用VEGF單克隆抗體包被發(fā)光板，能夠確保VEGF能被本試劑盒所檢測，能對標本有準確的測定。本試劑盒檢測生物標本中的VEGF，優(yōu)選來自癌癥、血管病病人或其他疾病病人的標本。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明局限于此。實施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例可以是下列物質(zhì)
(1)VEGF單克隆抗體包被固體發(fā)光板；
(2)酶結(jié)合物辣根過氧化物酶標記血管內(nèi)皮生長因子多克隆抗體，I瓶；
(3)VEGF標準品，2支;
(4)樣品稀釋液0.05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，O. 05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，l 瓶;
(5)濃縮洗滌液為137mMNaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 , O. 05% 吐溫-20，Ph7. 4, I瓶；
(6)發(fā)光底物A、B，其中A液為H2O2溶液，B液為魯米諾溶液，各I瓶；
(7)封板膠紙2張。本例所述的各種物質(zhì)量均以發(fā)光板為96孔(12條8孔或8條12孔)的例子計算的，如果發(fā)光板的孔數(shù)多于或少于96孔，則各物質(zhì)量也相應(yīng)或多或少。其制備方法
(I)VEGF基因的克隆
以人胎盤cDNA文庫為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。依據(jù)VEGF基因的報道序列設(shè)計引物，PCR反應(yīng)條件94°C變性40秒，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個循環(huán)后72 °C保溫10分鐘，反應(yīng)體系ddH2020. Ομ I
IOXBuffer2. 5 μ I
dNTP(IOmM)O. 5 μ I
3 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I 5 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
Taq 酶(5U/μ I)O. 5 μ I
模板 NDAO. 5 μ I
總體積25 μ I
凝膠電泳回收PCR擴增的片段，克隆到載體ΡΜΤ18-Τ中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。VEGF基因的重組質(zhì)粒命名為pMT18-l。DNA序列分析由上海博亞生物工程有限公司完成。(2)昆蟲表達載體的構(gòu)建
用Sal I、BamH I酶切質(zhì)粒ρΜΤ18_1，回收VEGF基因片段。同時用Sal I、BamH I酶切質(zhì)粒PFastBac-HT，回收4. 7kb片段。將VEGF基因片段與4. 7kb片段進行連接，構(gòu)建載體pFastBac-Ι。用不同的限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，表明所構(gòu)建載體正確。將載體pFastBac-Ι轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞。采用藍白斑篩選，24小時后將白斑劃到新平板上，確認其是否白斑。將菌落挑到2ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)12小時。提取培養(yǎng)的菌液中的質(zhì)粒方法如下
(a)將1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，10，OOOrpm離心30s，棄上清，將離心管倒立于紙巾上，使細菌沉淀盡可能干燥；
(b)加300 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，IOmM EDTA，pH8. 0),在震蕩器上振蕩混勻；
(c)加300μ I現(xiàn)配的溶液II (0. 2Ν NaOH，1%SDS)，混勻，室溫放置5分鐘；
(d)加300μ I預(yù)冷的溶液IIK5Μ KAc，ρΗ5· 5)，冰浴5分鐘；
(e)12, OOOrpm 離心 15 分鐘；
Cf)轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻；
(g)10，000-12，OOOrpm 離心 10 分鐘；
(h)用70%和無水乙醇洗滌沉淀；
(i)吹干，溶于50μ I 加 RNase 的 TE (IOmM Tris-HCl ; ImM EDTA, ρΗ8· 0)中，于 37°C放置一小時，置于_20°C備用。對提取的質(zhì)粒進行PCR鑒定，PCR反應(yīng)依據(jù)前述的方法。(3)轉(zhuǎn)染昆蟲細胞(以sf9細胞為例，但不僅限于sf9細胞，采用sf21、sf 158、cl27細胞株都可以得到相同的效果，在此不一一敘述)。sf9細胞培養(yǎng)于Grace培養(yǎng)液中，添加15%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50ug/ml，轉(zhuǎn)染方法如下
Ca)轉(zhuǎn)染前一天將細胞分到24孔板；
(b)轉(zhuǎn)染前2小時，更換新鮮無血清、無雙抗培養(yǎng)液，洗一次，然后加入500 μ I培養(yǎng)液； (C)在50 μ I無血清、無雙抗培養(yǎng)液中分別加入2μ I脂質(zhì)體、5 μ I前述的重組質(zhì)粒，室溫放置5分鐘，將質(zhì)粒加入到脂質(zhì)體中，室溫放置20分鐘；
Ce)將上一步驟的混合物加到細胞中，27°C培養(yǎng)；
(f)轉(zhuǎn)染4小時后，吸掉培養(yǎng)液，加入Iml新鮮有血清、有雙抗Grace培養(yǎng)液，27°C培養(yǎng)72小時；
(g)轉(zhuǎn)染72小時后，觀察是否有出毒跡象；
(h)將有桿狀病毒上清感染新sf9細胞。(4)昆蟲表達蛋白的純化(Ni柱吸附法)
(a)Ni柱的制備
(I )取Iml Ni-NTA到一離心管中，1500g離心5分鐘；
(II)去掉上清，將Ni-NTA用I倍體積的洗滌緩沖液(20mMTris-HCl，500mM KCl，20mM咪唑，2mM巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)重懸；
(III)將重懸液到入柱中，用5-10倍體積的washbuffer平衡；
(b)細胞抽提物的準備
(I ) 500g離心5分鐘收集50ml細胞；
(II)用裂解緩沖液(50mMTris-HCl，IOOmM KCl，20mM咪唑，5mM巰基乙醇，I mM苯甲基磺酰氟，PH8. 5)重懸細胞；
(III)10, OOOg離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一新管中；
(C )蛋白純化
(I )將上一步驟的上清液加到平衡好的Ni柱中；
(II)用10 倍體積的 buffer A (20mM Tris-HCl，500mM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗柱；
(III)用2 倍體積的 buffer B (20mM Tris-HCl，IM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，ρΗ8· 5)洗柱；
(IV)用2倍體積的bufferA洗柱；
(V)用5-10 倍 buffer C (20mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗脫，收集洗脫液；
(VI)用SDS-PAGE膠檢測所純化蛋白的濃度與純度。(5) VEGF單克隆抗體的制備及純化
以小鼠為免疫動物，重組VEGF為抗原進行免疫。根據(jù)小鼠免疫效價，挑選免疫效價最高的動物，取脾臟進行細胞融合，采用間接ELISA方法進行陽性雜交瘤細胞株的篩選。挑選有一個細胞團的陽性孔進行有限稀釋，一個孔中只有此一個克隆細胞團，中央密集成圓形向四周鋪開。待有限稀釋的所有的孔皆如此且全部檢測為陽性，可認為克隆完成。由其中單一細胞來源的雜交瘤分泌所得到的抗體為單克隆抗體。正辛酸一硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體，純度在95%以上。(6) VEGF多克隆抗體的制備、純化及標記
用家兔作為免疫動物，先用5-10mg卡介苗注射刺激動物。一周后，將VEGF蛋白制成弗氏完全佐劑，采用皮下多點注射進行第一次免疫。2周后，進行第二次免疫。2周后，試血并測效價。如效價偏低，則進行加強免疫。采集家兔全血，離心取血清。向血清中加入飽和硫酸銨,血清與硫酸銨的體積比為2:1，使抗體沉淀，離心分離，抗體純度達98%以上。采用戊二醛法將辣根過氧化物酶(HRP)標記到VEGF多克隆抗體上。(7)試劑盒的制備
發(fā)光板的包被采用以下步驟抗體用包被緩沖液稀釋一定的倍數(shù)，每孔加100 μ I。37°C水浴或溫箱中包被2小時，然后放在室溫過夜。每孔加滿PBST洗滌液，放置30秒左右，甩干。每孔加120 μ I封閉液，室溫放置2小時。封閉液配方主要含有BSA、一些鹽類等。甩掉封閉液，拍打除去殘余封閉液。超凈臺上吹干?；虺瑑襞_上吹數(shù)小時，然后室溫放置過夜。用真空包裝機進行包裝。實施例2 :試劑盒使用方法
1.從以平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條密封放回4°C ；
2.留一孔為空白孔，其他各孔加入樣品稀釋液 οομI (或2滴)；
3.除空白孔外，加入標準品稀釋液(用標準品稀釋8個梯度)、血清標本各100μ I至相應(yīng)孔中，輕彈混勻。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C 60分鐘；
4.洗板3次(1)自動洗板機甩盡孔內(nèi)液體，要求注入的洗滌液為350μ 1，注入與吸出間隔15-30秒，洗板3次。(2)手工洗板甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μ 1，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干，洗3次；
5.除空白孔外，每孔加酶結(jié)合物200μ I (或4滴)，封住板孔，37°C 60分鐘；
6.洗板3次；
7.發(fā)光反應(yīng)將發(fā)光底物A、B液各100μ I (或2滴)加到反應(yīng)孔(包括空白孔)內(nèi)；
8.輕微振蕩30秒，室溫(18— 25°C )避光反應(yīng)5分鐘后，用化學(xué)發(fā)光儀測定各孔發(fā)光
值；
9.以標準品濃度值為橫坐標(X軸)，以標準品發(fā)光強度值為縱坐標(Y軸)，建立標準曲線，計算測定結(jié)果。本發(fā)明具有的優(yōu)點
1.結(jié)果特異性強。本發(fā)明采用VEGF單克隆抗體為包被物包被固體發(fā)光板，因此，檢測VEGF的特異性高；
2.靈敏度高。檢測靈敏度能打到ng/L水平；
4.穩(wěn)定。本發(fā)明于4°C保存，有效期達9-12個月；
5.方便。本發(fā)明操作簡便，所需檢測儀器(化學(xué)發(fā)光儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)光檢測試劑盒，其組成為 反應(yīng)板、酶結(jié)合物、標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A、B和封板膠紙； 其中 反應(yīng)板為血管內(nèi)皮細胞生長因子單克隆抗體包被的固體反應(yīng)板； 酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標記血管內(nèi)皮生長因子多克隆抗體。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于 標準品為血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白凍干粉； 樣品稀釋液為0. 05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，pH6. 5; 濃縮洗滌液為 137mM NaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mMKH2P04，0. 05% 吐溫-20，Ph7. 4 ； 發(fā)光底物A、B，其中發(fā)光底物A為H2O2溶液，發(fā)光底物B為魯米諾溶液。
3.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于，各物質(zhì)的量以發(fā)光板的孔數(shù)為標準。
4.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光板為96孔。
5.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 Ca)將血管內(nèi)皮細胞生長因子單克隆抗體包被于固體支持物發(fā)光反應(yīng)板上； (b)用封閉液封閉； (C)將生物標本加入到預(yù)包被的發(fā)光反應(yīng)板反應(yīng)孔中，生物標本中的血管內(nèi)皮細胞生長因子特異地與血管內(nèi)皮細胞生長因子單克隆抗體結(jié)合； Cd)用血管內(nèi)皮細胞生長因子多克隆抗體檢測血管內(nèi)皮細胞生長因子； Ce)發(fā)光底物為魯米諾溶液。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟a所述的單克隆抗體是用血管內(nèi)皮細胞生長因子免疫小鼠所得。
7.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟c所述的生物標本為癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血清、血漿、腦脊液、唾液、組織提取液或尿液。
8.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟d所述的血管內(nèi)皮細胞生長因子多克隆抗體制備用的血管內(nèi)皮細胞生長因子用昆蟲細胞表達并用Ni柱純化。
9.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟d所述的多克隆抗體是用血管內(nèi)皮細胞生長因子免疫家兔所得。
10.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟d所述的多克隆抗體用辣根過氧化物酶標記。
11.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述的血管內(nèi)皮細胞生長因子用昆蟲細胞表達并用Ni柱純化。
全文摘要
一種檢測人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的發(fā)光檢測試劑盒。試劑盒盒體內(nèi)包括VEGF單克隆抗體包被的固體反應(yīng)板、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體加保護劑配置的酶結(jié)合物、VEGF標準品、樣品稀釋液、PBST濃縮洗液、魯米諾配置的發(fā)光底物、封板膠紙。本試劑盒可用于癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷和預(yù)后，具有準確、特異、靈敏、穩(wěn)定、方便等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK102798723SQ20121027450
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者鄒檢平 申請人:北京華創(chuàng)遠航科技有限公司