專利名稱：一種化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多階段的、復(fù)雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與宿主之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，其機(jī)理尚不甚清楚。近年來關(guān)于新的血管生成與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究進(jìn)展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移灶生長的必要條件，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)新血管生成的最重要的細(xì)胞因子。研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)在血管系統(tǒng)的發(fā)育分化中具有不可替代的作用(Ferrara et al.Endocr. Rev. 1997, 18:4-25)。 VEGF是一個(gè)分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個(gè)相同亞單位通過二硫鍵結(jié)合形成，等電點(diǎn)為8. 5，有很強(qiáng)的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構(gòu)體，分別為 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高親和力結(jié)合位點(diǎn)僅位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力(Kendall et al. PNAS USA, 1993，90:10705-9)。VEGF是癌癥生長、轉(zhuǎn)移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤(即癌癥)疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時(shí)，VEGF的血液濃度就高；而當(dāng)腫瘤因化療或手術(shù)“臨床治愈”時(shí)，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預(yù)后的指標(biāo)。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個(gè)重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定(chemiluminesent immunoassay, CLEIA)是免疫測定技術(shù)繼酶免技術(shù)、放免技術(shù)、突光免疫技術(shù)和時(shí)間分辨突光免疫技術(shù)之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測定技術(shù)。其基本原理是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測樣本中的抗原或抗體，由于它既具有免疫反應(yīng)的高度特異性，又具有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，近年來已被國內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室及科研單位，廣泛應(yīng)用于各種激素、特種蛋白及藥物的監(jiān)測和分析。該方法具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快捷、標(biāo)記物穩(wěn)定、無污染、儀器簡單經(jīng)濟(jì)等有點(diǎn)。目前，用過氧化氫和辣根過氧化物酶(HRP)聯(lián)合催化魯米諾類化合物發(fā)光的化學(xué)發(fā)光免疫測定效果比較好，應(yīng)用比較廣泛
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。該試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便、便于推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述發(fā)光檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為
I.反應(yīng)板；2.酶結(jié)合物；3.標(biāo)準(zhǔn)品；4.樣品稀釋液；5.濃縮洗滌液；6.發(fā)光底物Α、Β;7·封板膠紙。 本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
(a)以固體反應(yīng)板為固體支持物,將VEGF受體包被于固體支持物上；
(b)用封閉液封閉；
(c)將生物標(biāo)本與固定于固體反應(yīng)板上的VEGF受體接觸和保溫，生物標(biāo)本中的VEGF特異地與VEGF受體結(jié)合；
(d)從VEGF受體上分離生物標(biāo)本；
(e)用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的VEGF單克隆抗體檢測VEGF，所用的發(fā)光底物為魯米諾溶液。本發(fā)明試劑盒的獨(dú)特性在于，它使用VEGF受體包被反應(yīng)板，能夠確保VEGF能被本試劑盒所檢測，能對標(biāo)本有準(zhǔn)確的測定。本試劑盒檢測生物標(biāo)本中的VEGF，優(yōu)選來自癌癥、血管病病人的標(biāo)本。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例是為了更詳細(xì)的解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明局限于此。實(shí)施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例可以是下列物質(zhì)
(1)VEGF受體包被反應(yīng)板；
(2)酶結(jié)合物辣根過氧化物酶標(biāo)記血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體，I瓶；
(3)VEGF標(biāo)準(zhǔn)品，2支;
(4)樣品稀釋液0.05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，O. 05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，l 瓶;
(5)濃縮洗滌液為137mMNaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 , O. 05% 吐溫-20，Ph7. 4, I瓶；
(6)發(fā)光底物A、B，其中A液為H2O2溶液，B液為魯米諾溶液，各I瓶；
(7)封板膠紙2張。本例所述的各種物質(zhì)量均以反應(yīng)板為96孔(12條8孔或8條12孔)的例子計(jì)算的，如果反應(yīng)板的孔數(shù)多于或少于96孔，則各物質(zhì)量也相應(yīng)或多或少。其制備方法
(I)VEGF基因和VEGF受體基因的克隆
以人胎盤cDNA文庫為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。依據(jù)VEGF基因的報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)條件94°C變性40秒，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫10分鐘。依據(jù)VEGF受體基因的報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)條件94°C變性40秒，52 °C退火I分鐘，72 °C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫10分鐘；反應(yīng)體系
ddH2020. 0 μ I
IOXBuffer2. 5 μ I
dNTP(IOmM)O. 5 μ I
3 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
5 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
Taq 酶(5U/μ I)O. 5 μ I 模板 NDAO. 5 μ I
總體積25 μ I
凝膠電泳回收PCR擴(kuò)增的片段，克隆到載體ΡΜΤ18-Τ中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。VEGF基因的重組質(zhì)粒命名為pMT18-l，VEGF受體基因的重組質(zhì)粒命名為pMT18-2。DNA序列分析由上海博亞生物工程有限公司完成。(2)昆蟲表達(dá)載體的構(gòu)建
用Sal I ,BamH I分別酶切質(zhì)粒pMT18_l和pMT18_2，分別回收VEGF基因片段和VEGF受體基因片段。同時(shí)用Sal I > BamH I酶切質(zhì)粒pFastBac-HT，回收4.7kb片段。將VEGF基因片段和VEGF受體基因片段分別與4. 7kb片段進(jìn)行連接，構(gòu)建載體pFastBac-1和pFastBac-2。用不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，表明所構(gòu)建載體正確；
分別將載體PFastBac-I和pFastBac_2轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞。采用藍(lán)白斑篩選，24小時(shí)后將白斑劃到新平板上，確認(rèn)其是否白斑。將菌落挑到2ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；
提取培養(yǎng)的菌液中的質(zhì)粒方法如下
(a)將1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，10，OOOrpm離心30s，棄上清，將離心管倒立于紙巾上，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥；
(b)加300 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，IOmM EDTA，pH8. 0),在震蕩器上振蕩混勻；
(c)加300μ I現(xiàn)配的溶液II (0. 2Ν NaOH，1%SDS)，混勻，室溫放置5分鐘；
(d)加300μ I預(yù)冷的溶液IIK5Μ KAc，ρΗ5· 5)，冰浴5分鐘；
(e)12, OOOrpm 離心 15 分鐘；
Cf)轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻；
(g)10，000-12，OOOrpm 離心 10 分鐘；
(h)用70%和無水乙醇洗滌沉淀；
(i)吹干，溶于50μ I 加 RNase 的 TE (IOmM Tris-HCl ; ImM EDTA, ρΗ8· 0)中，于 37°C放置一小時(shí)，置于_20°C備用；
對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)依據(jù)前述的方法。(3)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(以sf9細(xì)胞為例，但不僅限于sf9細(xì)胞，采用sf21、sfl58、cl27細(xì)胞株都可以得到相同的效果，在此不一一敘述)
sf9細(xì)胞培養(yǎng)于Grace培養(yǎng)液中，添加15%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50ug/ml，轉(zhuǎn)染方法如下
Ca)轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分到24孔板；(b)轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，更換新鮮無血清、無雙抗培養(yǎng)液，洗一次，然后加入500 μ I培養(yǎng)液；(C)在50 μ I無血清、無雙抗培養(yǎng)液中分別加入2μ I脂質(zhì)體、5 μ I前述的重組質(zhì)粒，室溫放置5分鐘，將質(zhì)粒加入到脂質(zhì)體中，室溫放置20分鐘；
Ce)將上一步驟的混合物加到細(xì)胞中，27°C培養(yǎng)；
(f)轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，吸掉培養(yǎng)液，加入Iml新鮮有血清、有雙抗Grace培養(yǎng)液，27°C培養(yǎng)72小時(shí)；
(g)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，觀察是否有出毒跡象；
(h)將有桿狀病毒上清感染新sf9細(xì)胞。(4)昆蟲表達(dá)蛋白的純化(Ni柱吸附法)
(a)Ni柱的制備
(I )取Iml Ni-NTA到一離心管中，1500g離心5分鐘；
(II)去掉上清，將Ni-NTA用I倍體積的洗滌緩沖液(20mMTris-HCl，500mM KCl，20mM咪唑，2mM巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)重懸；
(III)將重懸液到入柱中，用5-10倍體積的washbuffer平衡；
(b)細(xì)胞抽提物的準(zhǔn)備
(I ) 500g離心5分鐘收集50ml細(xì)胞；
(II)用裂解緩沖液(50mMTris-HCl，IOOmM KCl，20mM咪唑，5mM巰基乙醇，I mM苯甲基磺酰氟，PH8. 5)重懸細(xì)胞；
(III)10, OOOg離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一新管中；
(C )蛋白純化
(I )將上一步驟的上清液加到平衡好的Ni柱中；
(II)用10 倍體積的 buffer A (20mM Tris-HCl，500mM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗柱；
(III)用2 倍體積的 buffer B (20mM Tris-HCl，IM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，ρΗ8· 5)洗柱；
(IV)用2倍體積的bufferA洗柱；
(V)用5-10 倍 buffer C (20mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗脫，收集洗脫液；
(VI)用SDS-PAGE膠檢測所純化蛋白的濃度與純度。(5) VEGF單克隆抗體的制備、純化及標(biāo)記
以小鼠為免疫動物，重組VEGF為抗原進(jìn)行免疫。根據(jù)小鼠免疫效價(jià)，挑選免疫效價(jià)最高的動物，取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA方法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選。挑選有一個(gè)細(xì)胞團(tuán)的陽性孔進(jìn)行有限稀釋，一個(gè)孔中只有此一個(gè)克隆細(xì)胞團(tuán)，中央密集成圓形向四周鋪開。待有限稀釋的所有的孔皆如此且全部檢測為陽性，可認(rèn)為克隆完成。由其中單一細(xì)胞來源的雜交瘤分泌所得到的抗體為單克隆抗體。正辛酸一硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體，純度在95%以上；
采用戊二醛法將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記到VEGF單克隆抗體上。(6)試劑盒的制備
反應(yīng)板的包被采用以下步驟受體用包被緩沖液稀釋一定的倍數(shù)，每孔加100 μ I。37°C水浴或溫箱中包被2小時(shí)，然后放在室溫過夜。每孔加滿PBST洗滌液，放置30秒左右，甩干。每孔加120 μ I封閉液，室溫放置2小時(shí)。封閉液配方主要含有BSA、一些鹽類。甩掉封閉液，拍打除去殘余封閉液。超凈臺上吹干。或超凈臺上吹數(shù)小時(shí)，然后室溫放置過夜。用真空包裝機(jī)進(jìn)行包裝。實(shí)施例2 :試劑盒使用方法。I.從以平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條請密封放回4°C。2.留一孔為空白孔，其他各孔加入樣品稀釋液100 μ I (或2滴)。3.除空白孔外，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋8個(gè)梯度)、血清標(biāo)本各100μ I至相應(yīng)孔中，輕彈混勻。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C 60分鐘。 4.洗板3次(1)自動洗板機(jī)甩盡孔內(nèi)液體，要求注入的洗滌液為350μ 1，注入與吸出間隔15-30秒，洗板3次。(2)手工洗板甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μ 1，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干，洗3次。5.除空白孔外，每孔加酶聯(lián)物200 μ I (或4滴)，封住板孔，37°C 60分鐘。6.洗板 3 次。7.發(fā)光反應(yīng)將發(fā)光底物A、B液各100 μ I (或2滴)加到反應(yīng)孔(包括空白孔)內(nèi)。8.輕微振蕩30秒，室溫(18 — 25°C)避光反應(yīng)5分鐘后，用化學(xué)發(fā)光儀測定各孔發(fā)光值。9.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)(X軸)，以標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)(Y軸)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測定結(jié)果。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)
1.結(jié)果特異性強(qiáng)。本發(fā)明采用VEGF受體為包被物包被酶聯(lián)板，因此，檢測VEGF的特異性高；
2.靈敏度高。檢測靈敏度能打到ng/L水平；
4.穩(wěn)定。本發(fā)明于4°C保存，有效期達(dá)9-12個(gè)月；
5.方便。本發(fā)明操作簡便，所需檢測儀器(化學(xué)發(fā)光儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。
權(quán)利要求
1.ー種發(fā)光檢測試劑盒，其組成為 反應(yīng)板、酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A、B和封板膠紙； 其中 反應(yīng)板為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體包被的固體反應(yīng)板； 酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于 標(biāo)準(zhǔn)品為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白凍干粉； 樣品稀釋液為0. 05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmMこニ胺四こ酸ニ鈉，0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，pH6. 5; 濃縮洗滌液為 137mM NaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mMKH2P04，0. 05% 吐溫-20，Ph7. 4 ； 發(fā)光底物A、B，其中發(fā)光底物A為H2O2溶液，發(fā)光底物B為魯米諾溶液。
3.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于，各物質(zhì)的量以反應(yīng)板的孔數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)。
4.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)板為96孔。
5.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 Ca)將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體包被于固體支持物固體反應(yīng)板上； (b)用封閉液封閉； (C)將生物標(biāo)本加入到預(yù)包被的固體反應(yīng)板反應(yīng)孔中，生物標(biāo)本中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子特異地與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體結(jié)合； Cd)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子單克隆抗體檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子； Ce)發(fā)光底物為魯米諾溶液。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟a所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體用昆蟲細(xì)胞表達(dá)。
7.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟c所述的生物標(biāo)本為癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血清、血漿、腦脊液、唾液、組織提取液或尿液。
8.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟d所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子單克隆抗體是用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子免疫小鼠所得。
9.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟d所述的單克隆抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記。
10.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞為sf9、sfl2、sn58或cl27細(xì)胞株。
11.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體用Ni柱純化。
12.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子用昆蟲細(xì)胞表達(dá)并用Ni柱純化。
全文摘要
一種檢測人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的發(fā)光檢測試劑盒。試劑盒盒體內(nèi)包括VEGF受體包被的固體反應(yīng)板、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體加保護(hù)劑配置的酶結(jié)合物、VEGF標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、PBST濃縮洗液、魯米諾配置的發(fā)光底物、封板膠紙。本試劑盒可用于癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷和預(yù)后，具有準(zhǔn)確、特異、靈敏、穩(wěn)定、方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/68GK102778452SQ201210278860
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者鄒檢平 申請人:北京健平九星生物醫(yī)藥科技有限公司