一種水產(chǎn)品中氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測水產(chǎn)品中氯霉素殘留的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于化學(xué)發(fā)光酶免疫分析領(lǐng)域。包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑；其中所述酶標(biāo)板包被有包被抗原，所述試劑包括：酶標(biāo)抗體即辣根過氧化物酶標(biāo)記氯霉素抗體，氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。本試劑盒原理為將包被抗原吸附在微孔板上制成固相抗原，在氯霉素抗體上連接辣根過氧化物酶制成酶標(biāo)記物，魯米諾體系作為發(fā)光底物，建立了氯霉素酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析法。該試劑盒靈敏度為0.0125ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于8％，批間變異系數(shù)小于20％，魚蝦樣品的回收率為87％——101％，檢測線性范圍0.0125——4.05ng/mL。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【專利說明】一種水產(chǎn)品中氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，用于水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]氯霉素(Chloramphenicol, CAP)最初是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)基中提取制得，是一類廣譜抗生素。氯霉素曾在我國畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，對畜禽的疾病控制和治療起到了重要作用。氯霉素存在著嚴(yán)重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血，粒狀白細(xì)胞缺乏癥，新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等，低濃度藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性，對人類的健康構(gòu)成巨大的潛在威脅。在美國僅允許氯霉素應(yīng)用于非食用性動(dòng)物，規(guī)定在任何動(dòng)物性食品中不得檢出氯霉素。歐共體禁止氯霉素應(yīng)用于產(chǎn)奶牛和產(chǎn)蛋雞，在其他動(dòng)物性食品中的含量也做了限制，規(guī)定最高殘留量為100ng/kg。中國農(nóng)業(yè)部已將氯霉素從2002年版《中國獸藥典》中刪除列為禁藥，近年已規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出。
[0003]作為全國淡水漁業(yè)第一省的湖北水產(chǎn)業(yè)，續(xù)十三年淡水產(chǎn)品總量保持全國第一。我省現(xiàn)有水產(chǎn)加工企業(yè)180家，其中加工出口企業(yè)19家。作為國家明令禁止使用的獸藥，在水產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中，氯霉素殘留一直被列為重點(diǎn)必檢項(xiàng)目之一。
[0004]目前，應(yīng)用廣泛的CAP檢測技術(shù)有液相色譜法(LC)、質(zhì)譜法(MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。LC等大型儀器分析方法對設(shè)備和操作者有較高要求，樣品處理方法復(fù)雜，檢測時(shí)間長。
[0005]目前已申請的氯霉素檢測相關(guān)專利中較多是采用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法檢測，如:江南大學(xué)申請?zhí)枮?2137940，名為《一種動(dòng)物性食品中氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法》；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)申請?zhí)枮?00410037254，名為《檢測氯霉素的試劑盒》；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)申請?zhí)枮?00410037255，名為《一種檢測氯霉素的試劑盒》；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)申請?zhí)枮?00410037258，名為《氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒》;中國農(nóng)業(yè)大學(xué)申請?zhí)?00410037259，名為《一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒》；北京望爾生物技術(shù)有限公司申請?zhí)?00510086775，名為《一種檢測動(dòng)物性食品中氯霉素類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒》等。這一方法中常用的顯色底物是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或者鄰苯二胺(OPD)，其中OPD具有致癌性，長期使用會(huì)對人體造成危害；且這類底物較不穩(wěn)定易受外界干擾使最終測定結(jié)果受到影響，如光照或金屬離子會(huì)使底物自身顯色。酶聯(lián)免疫吸附法是以酶催化底物顯色，通常需顯色10——60分鐘，使顯色達(dá)到平臺(tái)期，顯色完畢后需用酸終止顯色測定結(jié)果。
[0006]另外部分專利涉及到膠體金試紙法，如:博頓生物技術(shù)(杭州)有限公司申請?zhí)?00310109470，名為《檢測氯霉素的免疫膠體金試紙及其制備方法》；云南大學(xué)申請?zhí)?00610019376，名為《氯霉素膠體金檢測試紙》等。該方法適操作簡便，用時(shí)短用于大批量樣品篩查，但靈敏度較低，結(jié)果不準(zhǔn)確，易出現(xiàn)假陽性或假陰性。
[0007]還有部分專利有采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，如:上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院申請?zhí)?00410067401，名為《一種蜂蜜中氯霉素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法》；中國人民共和國江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局申請?zhí)?00810195887，名為《蜂產(chǎn)品中多類農(nóng)獸藥殘留同時(shí)檢測的方法》，這類方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，但樣品前處理過程繁瑣，需要用大量有機(jī)溶齊U，檢測需要大規(guī)模儀器。
[0008]此外還有天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司申請?zhí)?00810053150，名為《一種飼料或者獸藥中違禁藥物的快速檢測方法》，該專利采用薄層色譜法檢測違禁藥物，這一方法操作簡便，但樣品處理過程中通常使用大量的有機(jī)溶劑，且檢測結(jié)果只能定性判不能準(zhǔn)確檢測藥物含量。江南大學(xué)申請?zhí)?00910027458，名為《一種快速檢測氯霉素的免疫磁珠層析試紙條及其制備方法》，采用免疫磁珠層析試紙條檢測該方法與膠體金試紙法類似。江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所申請?zhí)?00910182284，名為《一種氯霉素的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒》，采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法，該方法需突破多次標(biāo)記，即將CAP-OVA包被在發(fā)光微粒上，合成生物素二抗，將鏈霉親和素包被在感光微粒上。本發(fā)明將具有高度靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，操作簡便，用時(shí)短，無需長時(shí)間顯色及終止，且靈敏度高，特異性好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法，用于水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應(yīng)用靈活、方便的特點(diǎn)。
[0010]本發(fā)明主要采用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法檢測氯霉素。其技術(shù)方案:一種氯霉素化學(xué)發(fā)光酶免疫分析試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有抗原，其中包被抗原是由氯霉素小分子和載體蛋白通過EDC(碳二亞胺)法偶聯(lián)制成的完全抗原；所述試劑包括:氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)抗體、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌溶液、發(fā)光溶液。
[0011]上述氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中:
[0012]所述包被抗原是由氯霉素小分子和載體蛋白通過碳二亞胺法偶聯(lián)制成的完全抗原；所述微孔板為48孔或96孔或其他孔數(shù)的可拆卸或不可拆卸酶標(biāo)孔板；所述酶標(biāo)抗體是由辣根過氧化物酶和氯霉素抗體通過過碘酸鈉法偶聯(lián)制成；所述氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別是從氯霉素純品中稀釋得到，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品中氯霉素濃度分別為:0.0125ng/mL、
0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、l.35ng/mL、4.05ng/mL ;所述化學(xué)發(fā)光液含緩沖液、魯米諾、對羥基苯丙烯酸、過硼酸鈉等。
[0013]用所述的試劑盒檢測氯霉素的方法，測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。順次向白色化學(xué)發(fā)光板中加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品和酶標(biāo)抗體，溫育洗滌后加入發(fā)光液檢測發(fā)光值，以加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測樣品的發(fā)光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算被測樣品中氯霉素的含量。
[0014]所述試劑盒檢測方法，向包被好的酶標(biāo)板中每孔加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品和酶標(biāo)物，在25-49°C下溫育15分鐘。洗滌后，每孔加入發(fā)光液，1-5分鐘后在化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測。以所得的標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0)，以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
[0015]所述的檢測氯霉素的方法，其樣品處理:
[0016]魚蝦樣品:取IOg去除脂肪的樣品勻漿化，稱量3g勻漿化的樣品與6mL乙酸乙酯混合IOmin, 4000g離心5min,轉(zhuǎn)移2mL乙酸乙酯上層到干凈的玻璃管中，50°C溫和氮?dú)饬髡舭l(fā)乙酸乙酯，脂肪殘留物溶于ImL正己烷混勻lmin，并加入ImL樣品稀釋液。渦旋混合lmin, 4000g離心分離5min。(注:如下層乳化,可將試管置于80°C水浴中5min左右，并再次進(jìn)行離心)，棄去上層，吸取100 μ L下層溶液用于檢測。最終檢測結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)
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[0017]所述試劑盒曲線靈敏度為0.0125ng/mL。
[0018]所述試劑盒精密度可達(dá)到批內(nèi)變異系數(shù)小于8%，批間變異系數(shù)小于20%。
[0019]所述試劑盒魚蝦樣品回收率在87.4--101%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1-反應(yīng)時(shí)間的選擇
[0021]圖2-氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0022]圖3-試劑盒的直觀示意圖
[0023]圖中:盒體(1)、酶標(biāo)板⑵、酶標(biāo)抗體工作液⑶、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液⑷——(11)、濃縮磷酸鹽緩沖液(12)、濃縮洗滌液(13)、發(fā)光液(14)
[0024]圖4-酶標(biāo)板的直觀示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1、包被抗原、酶標(biāo)抗體的制備及稀釋度的選擇
[0026]1.包被抗原的制備
[0027]稱取載體蛋白(牛血清白蛋白BSA)以超純水溶解，配制成濃度為5——30mg/mL的BSA溶液。稱取氯霉素以超純水溶解，配制成濃度為I——5mg/mL的CAP溶液。稱取EDC.HCl，加超純水溶解，配制成濃度為I——5mg/mL的EDC溶液。向EDC溶液中加入
0.1——0.5mL CAP溶液，混合2min，再將已活化的CAP溶液加入到0.5mL BSA溶液中，上下混合均勻后，室溫避光混合2h，收集偶聯(lián)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至30kDa超濾管，于冷凍離心機(jī)4°C下3000rpm離心5min,加等體積甘油混勻，-20°C凍存。
[0028]2.酶標(biāo)抗體的制備
[0029]稱取HRP溶解于超純水中，配制成濃度為I——10mg/mL的HRP溶液，4°C靜置過夜，使之充分溶解；次日取上述HRP溶液0.5mL并向其中加入0.025——ImL新配的0.01——IM NaIO4水溶液，混勻后放置冰箱避光攪拌5——20分鐘后取出。取出反應(yīng)液裝入透析袋中，4°C對pH4.0的醋酸溶液透析過夜。次日將透析后的混合物取出，調(diào)節(jié)混合物pH值，使其接近9.6 ;立即將0.5——5mg的氯霉素單抗加入，室溫避光攪拌。反應(yīng)結(jié)束后取混合液中加入0.05——0.5mL濃度為I——10mg/mL的NaBH4 ;然后將混合液超濾加等量甘油保存。
[0030]3.包被抗原與酶標(biāo)抗體濃度篩選
[0031]縱向用包被抗原按照1: 20K、1: 40Κ、1: 80Κ、1: IOOKU: 200Κ、1: 400Κ的系列稀釋度包被酶標(biāo)板，每種濃度包被2列，100 μ L/孔，O-4°C放置過夜。次日用洗滌液洗板5次，每次拍干；50——300 μ L/孔封閉液封閉，25——40°C放置0.5——2小時(shí)，洗板5次，每次拍干。
[0032]奇數(shù)列加入50 μ L/孔PBS緩沖液，偶數(shù)列加入50 μ L/孔濃度為4ppb的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后橫向用酶標(biāo)抗體按照1: 30K、1: 50Κ、1: 60Κ、1: 80Κ的稀釋度加入，每種
濃度加入2行，每孔加入50 μ L，室溫放置15-60分鐘，洗板5次，每次拍干，加入100 μ L/
孔TMB顯色劑，室溫避光放置5——45分鐘，加入50 μ L/孔終止液，450nm處測試OD值。
[0033]表1-包被抗原及酶標(biāo)抗體濃度選擇
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析試劑盒，其特征是由(I)包被有包被抗原的微孔板，(2)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，(3)酶標(biāo)抗體工作液，(4)緩沖液，(5)洗滌液，(6)發(fā)光液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是包被抗原(I)是由氯霉素小分子和載體蛋白(牛血清白蛋白BSA)通過EDC(碳二亞胺)法偶聯(lián)制成的完全抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是酶標(biāo)氯霉素抗體(3)該酶標(biāo)抗體是將辣根過氧化物酶通過過碘酸鈉法與氯霉素抗體連接，形成酶標(biāo)抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板(I)，其特征為48孔、96孔或其他孔數(shù)的可拆卸或不可拆卸微孔板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板，其制備:將包被抗原以包被緩沖液稀釋，每孔加入50-300 μ L置于4°C冰箱包被。次日將包被抗原的微孔板取出洗漆后每孔加50-300 μ L封閉液,置于25_40°C水浴鍋封閉0.5-2小時(shí)后再洗漆,拍干，用真空密封在4°C下保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征是發(fā)光液(6)，該發(fā)光液包含T緩沖液、魯米諾、對羥基苯丙烯酸、過硼酸鈉。
7.一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測氯霉素的方法，其特征是向微孔板中加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品和酶標(biāo)抗體，溫育洗滌后加入發(fā)光液檢測發(fā)光值，以加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測樣品的發(fā)光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算被測樣品中氯霉素的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測氯霉素的方法，其特征是操作為:向包被好的酶標(biāo)板中每孔加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品和酶標(biāo)物，在25-40°C下溫育15分鐘。洗滌后，每孔加入發(fā)光液1-5分鐘后在化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測。以所得的標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率(B/BJ，以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
9.根據(jù)權(quán)利要求7、8所述的檢測氯霉素的方法，其特征是樣品處理: 魚蝦樣品:取IOg去除脂肪的樣品勻漿化，稱量3g勻漿化的樣品與6mL乙酸乙酯混合IOmin, 4000g離心5min,轉(zhuǎn)移2mL乙酸乙酯上層到干凈的玻璃管中，50°C溫和氮?dú)饬髡舭l(fā)乙酸乙酯，脂肪殘留物溶于ImL正己烷混勻lmin，并加入ImL樣品稀釋液。渦旋混合lmin，.4000g離心分離5min。(注:如下層乳化，可將試管置于80°C水浴中5min左右，并再次進(jìn)行離心)，棄去上層，吸取100 μ L下層溶液用于檢測。最終檢測結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)I。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103575878SQ201210280415
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月9日
【發(fā)明者】陳建軍, 金偉, 崔海容, 馮漢利, 李娟娟, 余浩, 曾憲東 申請人:湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 武漢百仕康生物科技有限公司