專利名稱：分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離富集和檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素殘留的方法，尤其涉及一種以膜過濾及固相萃取作為前處理，基于液質聯用法分離富集和檢測水環(huán)境中氟喹諾酮類抗生素殘留的方法。
背景技術：
抗生素類藥物在環(huán)境中殘留所引發(fā)的環(huán)境污染問題，近年來備受人們的關注。在人禽的醫(yī)療中廣泛使用的氟喹諾酮類(FQs)抗生素如環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、諾氟沙星(NOR)和氧氟沙星(0FL)，由于具有水溶性較好、動物體內代謝率較低，以及在環(huán)境中不易降解等特點，使其容易在水環(huán)境中不斷富集和儲存，是環(huán)境中主要抗生素污染源。由于其含量極低(納克級)，因此，建立相應的分離富集技術及檢測方法十分必要。目前對水環(huán) 境樣品中的抗生素分析常用固相萃取分離富集作為前處理方法。雖然抗生素種類繁多，但其化學性質相似，檢測方法總體可以歸為3大類化學測定法、色譜測定法和免疫測定法。其中，酶聯免疫法試樣預處理簡單、特異性強，但由于抗體的批次不同，測定結果可能出現微小差異，靈敏度不高；其他微生物法易操作，費用低，可用于大量樣品的篩選，但是靈敏度不高，且特異性差；HPLC-UV/FLU法儀器操作方便，樣品前處理簡單，靈敏度高；LC-MS/MS法樣品前處理簡單，選擇性好，靈敏度高，檢測限低，基本可應用于任何低含量物質的檢測。固相萃取技術是一種發(fā)展迅猛的樣品前處理技術，Oasis HLB固相萃取小柱具有較好親水親油平衡性，在水體基質中對氟喹諾酮類抗生素物質具有較好的吸附能力。合理選擇溶劑處理萃取小柱后可以實現對水樣中氟喹諾酮類抗生素的富集與純化。液質聯用技術是當前使用較為廣泛的儀器分析技術之一，具有液相色譜高分離能力和質譜精準定性定量的共同優(yōu)勢，通過對液相條件與質譜條件的優(yōu)化，能夠準確分析檢測經過前處理后的水樣中目標物的含量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，該方法具有低檢測限、高回收率、高靈敏度、選擇性好且操作簡便等優(yōu)點。本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現的
一種分離富集和檢測水環(huán)境中氟喹諾酮類抗生素殘留的方法，是將2. 0-4. OL水樣通過固相萃取后，用液相質譜串聯四級桿-飛行時間質譜儀(LC-MS/MS(Q-TOF))進行分析檢測。上述所說的方法中，所述固相萃取方法為用2_4ml甲醇、2_4ml超純水依次活化固相萃取小柱，將2. 0-4. OL水樣以4. 0-6. OmL/min的流速通過活化后的固相萃取小柱，用5-8mL磷酸、5-8mL超純水依次淋洗小柱；然后真空干燥小柱5_10min,用2_4mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣吹至ImL以下,倒入安捷倫小瓶后再用甲醇定容至ImL ;加入O. 5-1. OmL內標物。
上述所說的方法中，固相萃取小柱選用的是Oasis HLB。上述所說的方法中，通過質譜圖中離子強度值和內標法定量，內標物選用的是沙拉沙星、洛美沙星或左氧氟沙星。其原理如下
前處理部分0asis HLB固相萃取小柱具有較好親水親油平衡性，在水體基質中對氟喹諾酮類抗生素物質具有較好的吸附能力。通過選擇性吸附目標物，使其保留在柱填料中得以純化和富集，再通過淋洗去除同時保留的部分其它 雜質，進一步純化目標物，最后以有機溶劑將之從柱填料洗脫到溶劑中。儀器分析部分用高精度分析儀器準確檢測，其中通過液相的良好分離能力將多種目標物分離，再通過質譜的精準定性定量能力，通過內標法得到其準確含量值。本發(fā)明融合了固相萃取良好富集提純能力與液質聯用儀器高分離定性定量能力，以及加入標準內標物精確定量的特點，使得分析河水、湖泊水甚至自來水中極其痕量的氟喹諾酮類抗生素效果顯著?？傊景l(fā)明能很好的分離檢測多種氟喹諾酮類抗生素物質，具有低檢測限、高回收率、高靈敏度、選擇性好且操作簡便等優(yōu)點，對水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素物質的檢測研究效果顯著。


圖I為過柱流速對回收率的影響；
圖2為洗脫劑體積對回收率的影響；
圖3為萃取體積對回收率的影響；
圖4為四種氟喹諾酮類抗生素離子譜圖。
具體實施例方式下面結合具體實施實例對本發(fā)明做進一步說明。實施例I :固相萃取條件的選擇
一、活化劑選擇
氟喹諾酮類抗生素物質通常使用甲醇或乙腈進行活化，本發(fā)明中初步采用甲醇進行試驗，結果發(fā)現，2-4ml甲醇即可很好的使萃取柱達到完全潤濕狀態(tài)。此外，為去除甲醇殘留在柱內給富集過程帶來干擾,將小柱在2-4ml甲醇活化后用2-4ml水沖洗。二、淋洗劑選擇
淋洗的作用是在填料保留目標物的前提下將固相萃取柱上的雜質去除，從而進一步純化目標物。對氟喹諾酮類抗生素而言，通常使用弱酸性無機溶劑，本發(fā)明中選用5-8mL磷酸(調pH為3. O) +5-8mL超純水作為淋洗劑。三、過柱流速選擇
過柱流速對實驗的影響意義重大，本發(fā)明中通過控制過柱流速分別為4mL/min、6mL/min、8mL/min和10mL/min,保持其他條件相同的情況下進行對比。流速對目標物回收率的影響見圖1，由圖I可知，流速為6mL/min時，目標物的回收率已達到飽和。故本發(fā)明過柱流速選用 4. 0-6. OmL/min。
四、洗脫劑與洗脫體積選擇
固相萃取的洗脫劑一般可與活化劑中的有機溶劑相同或類似。本發(fā)明通過實驗發(fā)現，5mL甲醇即可將目標物完全洗脫，故采用甲醇作為固相萃取洗脫劑。為確定洗脫劑的體積，實驗中在保證其他條件相同的情況下，分別使用了 2mL、3mL、4mL和5mL的甲醇進行洗脫并對比分析，結果見圖2。由圖2可知，對于本發(fā)明中的Oasis HLB固相萃取小柱而言，洗脫體積在4mL吋，目標物的回收率已經達到最大值，不再隨洗脫劑體積的増大而發(fā)生明顯變化。因此，本發(fā)明中固相萃取洗脫劑體積可選為2-4mL。萃取小柱飽和吸附狀態(tài)的體積亦稱穿透體積(Break thro U gh volume ),可用來衡量固相萃取小柱的容量；穿透體積越大，萃取小柱對目標物的吸附能力越大，富集倍數也越大，萃取體積宜在保證固相萃取小柱穿透體積的前提下盡量提高富集倍數。本發(fā)明中分別采用水樣體積為0. 5L、1L、2L、3L和4L進行對比實驗，得到各物質回收率見圖3。因此，本發(fā)明中萃取體積可選為2. 0-4. OL。實施例2
準確量取2. 0-4. OL水樣，靜置后經0. 45 iim混合濾膜過濾待用；將supelC012管、固相萃取裝置、Oasis HLB萃取小柱、緩沖裝置和真空泵按順序接好,用2_4ml甲醇、2_4ml超純水依次活化小柱后，通過大容量采樣管將其與水樣連接；啟動真空泵，調節(jié)真空壓カ以控制萃取流速在4. 0-6. OmL/min，待水樣全部過柱后，用5-8mL磷酸(調pH=3. 0)、5_8mL超純水依次淋洗小柱；然后真空干燥(45°C)小柱5-10min，用2_4mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣在30°C下吹至ImL以下,倒入安捷倫小瓶后再用甲醇定容至ImL ;加入0. 5-1. OmL 100 u g/L的標準沙拉沙星溶液作為內標物，放進4°C冰箱中避光儲藏待用。實施例3 :檢測方法的建立 一、液相條件優(yōu)化
對于質譜儀器來說，禁止使用磷酸作為流動相；而對于四級桿串聯飛行時間類的質譜儀，其準進入的流動相中嚴格限制三こ胺；同時，液質聯用的流動相流速也比單純的液相色譜低得多。據此建立了表I中的液相檢測條件。表I LC-MS/MS檢測條件
權利要求
1.分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述方法為將2. 0-4. OL水樣通過固相萃取后，用液相質譜串聯四級桿-飛行時間質譜儀進行分析檢測。
2.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述水樣靜置后經0. 45 y m混合濾膜過濾待用。
3.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于通過質譜圖中離子強度值和內標法定量。
4.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述固相萃取方法為用2-4ml甲醇、2-4ml超純水依次活化固相萃取小柱，將2.0-4. OL水樣以4. 0-6. OmL/min的流速通過活化后的固相萃取小柱，用5_8mL磷酸、5_8mL超純水依次淋洗小柱；然后真空干燥小柱5-10min，用2-4mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣吹至ImL以下,倒入安捷倫小瓶后再用甲醇定容至ImL ;加入0. 5-1. OmL內標物。
5.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述固相萃取小柱為Oasis HLB。
6.根據權利要求4所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述內標物為沙拉沙星或洛美沙星或左氧氟沙星。
7.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述液相具體要求如下 流動相采用乙酸作為A相，超純水為B相，進樣量=IOuL,流速0. 1-0. 4mL/min,柱溫25-35°C，紫外檢測器波長280nm。
8.根據權利要求7所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述流動相梯度為流動相初始比例為V (A)V (B)=81:19，30min后為V (A)=V(B) =53:47,32min后變?yōu)槌跏急壤?br> 9.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述質譜具體要求如下 干燥器溫度3500 °C，氣體流速9L/min，噴霧壓力30-40psig，毛細管電壓3200-3800V，檢測破碎電壓80-120V。
10.根據權利要求I所述的分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，其特征在于所述方法具體步驟如下 準確量取2. OL水樣，靜置后經0. 45 ii m混合濾膜過濾待用；將supelC012管、固相萃取裝置、Oasis HLB萃取小柱、緩沖裝置和真空泵按順序接好,用2ml甲醇、2ml超純水依次活化小柱后，通過大容量采樣管將其與水樣連接；啟動真空泵，調節(jié)真空壓力以控制萃取流速在6. OmL/min,待水樣全部過柱后,用5mL磷酸(調pH=3. 0)、5mL超純水依次淋洗小柱；然后真空干燥(45°C)小柱5min，用4mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣在30°C下吹至ImL以下，倒入安捷倫小瓶后再用甲醇定容至ImL ;加入0. 5mL100 U g /L的標準沙拉沙星溶液作為內標 物；采用3M乙酸(含13. 2v. %乙腈)作為A相，超純水為B相，流動相初始比例為V (A) V(B) =81:19，30min后為V (A) :V (B) =53:47，32min后變?yōu)槌跏急壤?0°C柱溫條件下進樣IOy L以0. 4mL/min的流速通過色譜柱，采用紫外檢測器(波長280nm)進行檢測；質譜儀分別設置干燥器溫度3500°C，氣體流速9L/min，噴霧壓力30psig，毛細管電壓3500V，檢測破碎電壓 85V，即完成了分離富集和檢測。
全文摘要
分離富集并檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素的方法，涉及一種分離富集和檢測水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素殘留的方法。本發(fā)明的分離富集和檢測水環(huán)境中氟喹諾酮類抗生素殘留的方法是將2.0-4.0L水樣通過固相萃取后，用液質聯用儀器進行分析檢測。本發(fā)明能很好的分離檢測多種氟喹諾酮類抗生素物質，具有低檢測限、高回收率、高靈敏度、選擇性好且操作簡便等優(yōu)點，對水環(huán)境中痕量氟喹諾酮類抗生素物質的檢測研究效果顯著。
文檔編號G01N30/08GK102798689SQ20121028986
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權日2012年8月15日
發(fā)明者徐勇鵬, 崔鵬, 王媛 申請人:哈爾濱工業(yè)大學