專利名稱：一種d二聚體檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種檢測人D ニ聚體的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
纖維蛋白溶解系統(tǒng)是人體最重要的抗凝系統(tǒng)。當(dāng)纖維蛋白凝結(jié)塊形成吋，纖維蛋白溶解過程開始，并將纖維蛋白凝結(jié)塊溶解形成各種可溶片段，Dニ聚體即是其中最重要的可溶性片段之一。人體纖溶系統(tǒng)，它對保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動(dòng)狀態(tài)和組織修復(fù)·起著重要作用。Dニ聚體血漿中水平增高說明存在繼發(fā)性纖溶過程。溶栓治療是指用藥物來活化纖維蛋白溶解系統(tǒng)。一般為投入一種纖溶酶原活化物如尿液酶、鏈激酶或組織型纖溶酶原活化物，使大量纖溶酶生成，從而加速已形成血栓的溶解。D ニ聚體生成，則表明達(dá)到溶栓效果。纖溶蛋白降解產(chǎn)物中，唯D ニ聚體交聯(lián)碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此，理論上，D ニ聚體的定量檢測可定量反映藥物的溶栓效果、及可用于診斷、篩選新形成的血栓。D ニ聚體是測定纖溶系統(tǒng)主要因子，對于診斷與治療纖溶系統(tǒng)疾病及與纖溶系統(tǒng)有關(guān)疾病以及溶栓治療監(jiān)測，有著重要的意義。D ニ聚體是深靜脈血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的關(guān)鍵指標(biāo)。自從1971年Wilson等首先將纖維蛋白降解產(chǎn)物用于臨床診斷以來，D ニ聚體的檢測在診斷肺動(dòng)脈栓塞方面發(fā)揮了巨大的作用，隨著研究的開展和深入，臨床工作者對D ニ聚體的意義認(rèn)識日益深刻。D ニ聚體測定方法很多，包括(一)放射免疫測定法(RIA)、(ニ)酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、(三)乳膠凝集試驗(yàn)和免疫比濁法、(四)熒光免疫測定法、(五)滴金免疫法。這些方法具有操作繁瑣、耗時(shí)長、過度浪費(fèi)資源的缺點(diǎn)，不適于常規(guī)檢驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種D ニ聚體的檢測試劑盒。該試劑盒可直接應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀上，結(jié)果準(zhǔn)確性強(qiáng)、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。本發(fā)明的另ー目的是提供上述檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為
試劑Rl :緩沖液、聚こニ醇、疊氮鈉、こニ胺四こ酸鈉、牛血清白蛋白；
試劑R2 :緩沖液、結(jié)合有D ニ聚體單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、こニ胺四こ酸鈉、牛血清白蛋白。本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
(a)按下列比例配制好試劑試劑Rl
Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚こニ醇5-10 mmol /I,
疊氮鈉1-5 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200-220mmol/L
結(jié)合有D ニ聚體單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v)
吐溫-20l-5mmol/L
疊氮鈉0. 5-3 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應(yīng)；
(c)用半/全自動(dòng)生化分析儀測定吸光度變化值；
Cd)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中D ニ聚體的濃度。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例是為了更詳細(xì)的解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明局限于此。實(shí)施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例是雙試劑，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚こニ醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結(jié)合有D ニ聚體單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。實(shí)施例2 :試劑盒使用方法。I.試劑準(zhǔn)備，試劑為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚こニ醇8 mmol /I,疊氮鈉5 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結(jié)合有D ニ聚體單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,·
疊氮鈉3 mmol/L
こニ胺四こ酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自動(dòng)生化儀參數(shù)設(shè)置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為570nm；
(c)反應(yīng)時(shí)間8分鐘，其中，溫育時(shí)間5分鐘，反應(yīng)時(shí)間10秒鐘，檢測時(shí)間3分鐘。3.檢測步驟(全部在全自動(dòng)生化分析儀中完成)
(a)取150ii L試劑I和7 ii L血清樣本混勻；
(b)將混勻后的溶液在37°C溫育5分鐘；
(c)再添加50ii L試劑2，反應(yīng)10秒鐘后，在570nm下監(jiān)測3分鐘的吸光度變化值。4.通過吸光度變化值計(jì)算出D ニ聚體的濃度。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)
該試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性強(qiáng)、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。
權(quán)利要求
1.一種D 二聚體檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2， 其中 a、試劑Rl 包括200-220mmol/L Tris 緩沖液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、試劑R2200-220mmol/L Tris緩沖液、結(jié)合有D 二聚體單克隆抗體的乳膠粒子、l_5mmol/L 吐溫 _20、0. 5-3 mmol/L 疊氣納、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸納、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于試劑R2中的D二聚體單克隆抗體的乳膠粒子的制備方法為10. 5mg/ml的D 二聚體單克隆抗體與10%的乳膠顆粒(直徑50_100nm)，加入到200-220mmol/L Tris緩沖液中，震蕩反應(yīng)4小時(shí)，離心去上清，再用200-220mmol/L Tris緩沖液稀釋至O. 5%，并加入O. 1-0. 3 mmol/L疊氮鈉。
3.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配制好試劑 試劑Rl Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 疊氮鈉1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L 試劑R2 Tris 緩沖液 200-220mmol/L 結(jié)合有D 二聚體單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v) 吐溫-20l-5mmol/L 疊氮鈉0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應(yīng)； (c)用半/全自動(dòng)生化分析儀測定吸光度變化值； Cd)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中D 二聚體的濃度。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，被測樣品與試劑比例應(yīng)控制在I: 25到I :35之間。
5.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，反應(yīng)溫度為37(±1) °C。
6.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，反應(yīng)時(shí)間為8分鐘。
7.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，用半/全自動(dòng)生化分析儀檢測的波長為570nm。
全文摘要
一種D二聚體的檢測試劑盒。試劑盒盒體內(nèi)包括試劑R1緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；試劑R2緩沖液、結(jié)合有D二聚體單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于半/全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長570nm處吸光度變化的速度，從而測算出D二聚體的濃度大小。本試劑盒具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、方便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/577GK102788878SQ20121029087
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者謝兵 申請人:北京恩濟(jì)和生物科技有限公司