專利名稱：快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法以及采用的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法及其采用的檢測(cè)工具。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌，尤其是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)長(zhǎng)時(shí)間居于世界最重要的癌癥之一。其患病率在我國呈逐年上升趨勢(shì)，該病手術(shù)切除率低，5年生存率不到5%，現(xiàn)居我國癌癥死因的第2位。肝癌通常進(jìn)展緩慢，在早期階段無癥狀。目前，結(jié)合血清甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)和肝臟的超聲檢查是監(jiān)測(cè)和篩查肝癌的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，這些方法的敏感性和特異性有限。許多研究表明，AFP檢測(cè)的敏感性較低(僅5(Γ60%)且其診斷準(zhǔn)確性不能令人滿意。而肝臟的超聲檢測(cè)則對(duì)操作者依賴較高且當(dāng)腫瘤直徑小于2cm時(shí)假陰性率較聞。蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，在許多細(xì)胞過程如蛋白構(gòu)象、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)與穩(wěn)定中都起著重要作用。與此同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，細(xì)胞-細(xì)胞間信號(hào)傳遞、免疫應(yīng)答，病原微生物的發(fā)病機(jī)制及許多其他生物學(xué)過程也受糖基化的影響。更重要的是，現(xiàn)有研究已確定，在多種疾病中糖蛋白的糖基化發(fā)生了異常改變，可作為疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。高爾基體蛋白73 (Golgi Protein73，GP73)是存在于高爾基體主要在上皮細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白。在正常肝臟中，GP73主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，在肝細(xì)胞中很少表達(dá)或幾乎不表達(dá)。但是，在病毒性和非病毒性肝病中，GP73的表達(dá)劇烈上調(diào)。一項(xiàng)近期的研究在人類血清中檢測(cè)到了 GP73，并且在肝癌土撥鼠模型中發(fā)現(xiàn)GP73表達(dá)量在肝癌土撥鼠模型的血清和組織中均上調(diào)。Marreo等的研究表明GP73可用于肝癌早期診斷的參考，且其診斷敏感性高于AFP，此研究包括352個(gè)樣本與肝硬化患者相比，肝癌患者的血清GP73水平顯著上升，若以10個(gè)相對(duì)單位為臨界值，則GP73在肝癌診斷中的特異性為75%，敏感性為69%。此外，作為早期肝癌的診斷參考，GP73的效果優(yōu)于AFP。因此，GP73是對(duì)肝癌診斷非常有價(jià)值的生物標(biāo)志物，GP73聯(lián)合AFP檢測(cè)可提高肝癌的早期診斷率。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因8 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesionmolecule8, CEA)是一種具有人類胚胎抗原特異性決定簇的富含多糖的酸性糖蛋白，1965年首次在正常胎兒消化道及結(jié)腸癌組織中被發(fā)現(xiàn)，屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原?，F(xiàn)有研究顯示，CEA是一種廣泛的人類腫瘤相關(guān)抗原。在結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌等患者血清中，CEA濃度呈現(xiàn)不同程度的升高，這可能是因?yàn)榉置贑EA的腫瘤多數(shù)位于空腔臟器(如胃腸道，呼吸道，泌尿道等)而正常情況下CEA直接經(jīng)胃腸道得到代謝，只有在腫瘤狀態(tài)時(shí)CEA通過血液和淋巴循環(huán)使得血清CEA濃度上升。CEA是目前最常用的腫瘤標(biāo)志物之一，對(duì)于B超，CT等影像學(xué)方法難以診斷的惡性腫瘤，測(cè)定血清CEA濃度發(fā)揮了其潛在的優(yōu)勢(shì)。CEA的閾值因不同方法而略有不同，但其含量無明顯性別差異，僅隨年齡增大略有升高。據(jù)報(bào)道，聯(lián)合使用AFP和CEA作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行血清濃度檢測(cè)有利于肝癌的早期診斷，也可用于原發(fā)性肝癌的鑒別。
然而，雖然血液中的一些因子能夠隨體液循環(huán)到達(dá)唾液腺，或隨唾液分泌進(jìn)入口腔或?qū)е峦僖褐械幕蜣D(zhuǎn)錄譜發(fā)生改變，引起某些蛋白質(zhì)的豐度或種類改變，從而反映出血液中部分蛋白質(zhì)水平的變化。但目前研究發(fā)現(xiàn)，人唾液中有1939種蛋白質(zhì)，人血漿中有3020種蛋白質(zhì)，僅有27%的唾液蛋白質(zhì)組與血漿蛋白質(zhì)組重合。血漿蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的177個(gè)與心血管疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)中，也僅有40%的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在唾液蛋白質(zhì)組中；在已列出的1058個(gè)潛在癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)中，僅有34%的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在唾液蛋白質(zhì)組中。這表明許多血液循環(huán)中的生物標(biāo)志物并非能夠在唾液中得到鑒定。另外，即使是同一的蛋白，較之于血清，其在唾液中的含量通常明顯較低。因此在實(shí)踐中，兩者沒有必然的聯(lián)系，往往需要研究人員經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)和分析，并做針對(duì)性的檢測(cè)環(huán)節(jié)的調(diào)整改變，才能判斷是否有蛋白質(zhì)組重合的可能性。綜上所述，可以預(yù)期，若采用檢測(cè)血清樣本中生物標(biāo)志物的方法，則取樣不便、檢
測(cè)過程復(fù)雜、存在感染一些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法，并設(shè)計(jì)了針對(duì)唾液樣本的免疫層析試紙條，從而真正實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)，安全簡(jiǎn)便地檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物。本發(fā)明的試紙條的基本技術(shù)方案如下針對(duì)唾液樣本檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的免疫層析試紙條，包括沿層析方向依次設(shè)置的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、以及用于吸收檢測(cè)樣品中多余液體的吸水墊，樣品墊上粘附標(biāo)有指示線的膠帶；其特殊之處在于所述金標(biāo)墊是吸附有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標(biāo)識(shí)有檢測(cè)帶Tl和質(zhì)控線C ;其中，所述檢測(cè)帶Tl固化有單克隆抗體GP73-2，質(zhì)控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig?；谝陨匣炯夹g(shù)方案，還可以對(duì)該試紙條進(jìn)行以下優(yōu)化改進(jìn)作為金標(biāo)墊的玻璃纖維，還吸附有膠體金標(biāo)記的CEA-I ;在檢測(cè)帶Tl與質(zhì)控線C之間還標(biāo)識(shí)有檢測(cè)帶T2，檢測(cè)帶T2固化有單克隆抗體CEA-2。檢測(cè)帶Tl、檢測(cè)帶T2、質(zhì)控線C依次相隔2毫米、4毫米。以質(zhì)量計(jì)，膠體金標(biāo)記的單克隆抗體CEA-I在金標(biāo)墊上的含量與膠體金標(biāo)記的單克隆抗體GP73-1的含量相同，固化于檢測(cè)帶Tl上的單克隆抗體GP73-2與固化于檢測(cè)帶T2上的單克隆抗體CEA-2的含量相同。對(duì)于上述基本形式和改進(jìn)形式(檢測(cè)區(qū)增加了檢測(cè)帶T2)的試紙條，膠體金標(biāo)記的單克隆抗體在金標(biāo)墊上的含量均可以按照以下方式優(yōu)化限定所述金標(biāo)墊是將玻璃纖維充分浸泡于濃度為4 10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液所得；所述濃縮度的倍數(shù)按照以下方式確定120 μ g的單克隆抗體與膠體金溶液反應(yīng)((對(duì)于GP73-1和CEA-I兩種共同作用的情況，可以各取60 μ g與膠體金溶液反應(yīng)))，最終得到的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體溶于ImL的PBS溶液(PBS溶液的較佳選擇0. 01mol/L pH8. 0，并含O. 2%BSA)中，設(shè)其為10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，較低濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液是采用相同的PBS按照體積比對(duì)其稀釋得到；
固化于檢測(cè)帶上的單克隆抗體含量按照以下方式限定單克隆抗體用O. 01mol/LpH7. 2的PBS稀釋至濃度為I 4mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測(cè)帶。上述金標(biāo)墊最好是將玻璃纖維充分浸泡于濃度為5倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液所得；單克隆抗體最好用O. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測(cè)帶。以上關(guān)于對(duì)膠體金標(biāo)記的單克隆抗體在金標(biāo)墊上的含量和固化于檢測(cè)帶上的單克隆抗體含量的限定，本申請(qǐng)采用了本領(lǐng)域慣常的描述方式，較之于其他限定方式，這種限定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員(包括試紙條的使用者)不僅是清楚的，而且在明確該試紙條的成分和效果方面更有意義。制備上述一種免疫層析試紙條的方法，包括以下環(huán)節(jié)(I)膠體金制備采用氯金酸溶液制備得到膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)至8. 0，加入單克隆抗體GP73-1和CEA-I各60μ g混勻，兩種單克隆抗體的總濃度為12 μ g/mL ;反應(yīng)后,2000rpm離心,去沉淀,對(duì)上清液12000rpm離心，然后棄上清，沉淀溶于ImL的含O. 2%BSA的O. 01mol/L pH8. O的PBS溶液中，即為10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，然后用PBS將其稀釋為5倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，將玻璃纖維在此膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液中充分浸泡后取出，冷凍干燥，得到備用的金標(biāo)墊；(3)抗體包被單克隆抗體GP73-2和CEA-2分別用0. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL各5mL ;分別依次在NC膜上劃線，使單克隆抗體固化在硝酸纖維素膜上；膜干燥后完全浸泡于含1%BSA的0. 01mol/L pH7. 2的PBS中；然后取出硝酸纖維素膜用PBS清洗，干燥后得到備用的硝酸纖維素膜；(4)試紙條的組裝樣品墊采用吸水玻璃纖維，吸水墊采用吸水濾紙；將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝構(gòu)成試紙條，并將整個(gè)試紙條貼附于PVC板中央，裁切為適用寬度；然后密封干燥保存?zhèn)溆?。采用上述基本形式的試紙條(檢測(cè)區(qū)設(shè)置有檢測(cè)帶Tl和質(zhì)控線C)，實(shí)現(xiàn)快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法，是取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(Γ15分鐘后唾液樣本出現(xiàn)在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測(cè)帶以及質(zhì)控線顯色狀態(tài)，得到以下三種檢測(cè)結(jié)果之一(I)檢測(cè)帶Tl以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73 ；(2)僅質(zhì)控線C顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73 ；(3)無紫紅色條帶顯現(xiàn)；則表明試紙條失效，該檢測(cè)過程無效。采用上述改進(jìn)形式的試紙條(檢測(cè)區(qū)設(shè)置有檢測(cè)帶Tl、檢測(cè)帶Τ2和質(zhì)控線C)，實(shí)現(xiàn)快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法，是取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(Γ15分鐘后唾液樣本出現(xiàn)在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測(cè)帶以及質(zhì)控線顯色狀態(tài)，得到以下四種檢測(cè)結(jié)果之一(I)檢測(cè)帶Tl和檢測(cè)帶T2以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有聞爾基體蛋白73和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8 ；(2)檢測(cè)帶T2以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8;(3)僅質(zhì)控線C顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8;(4)無紫紅色條帶顯現(xiàn)或者檢測(cè)帶Tl顯現(xiàn)而檢測(cè)帶T2不顯現(xiàn)；則該次檢測(cè)無效。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過取唾液樣本作為檢測(cè)對(duì)象，具有科學(xué)性和可行性，并具有非損傷性檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。較之于血清樣本以及其他可能的體液樣本(如腦脊液、尿液等)，本發(fā)明更易于采集樣本，無創(chuàng)，檢測(cè)準(zhǔn)確(實(shí)際上更準(zhǔn)確)、安全簡(jiǎn)便、成本低且易于保存。檢測(cè)GP73得出的定性結(jié)論即可作為早期診斷的參考。


圖I為針對(duì)唾液樣本檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式唾液檢測(cè)的難度在于首先唾液中98%以上的組分都是水，蛋白質(zhì)和鹽類及一些酶組分僅占非常小的比例。因此對(duì)于唾液中蛋白質(zhì)組尤其是糖蛋白質(zhì)組的鑒定存在較大困難。其次，可用于檢測(cè)的生物標(biāo)志物蛋白往往屬于低豐度蛋白，即便在血漿中也存在一定鑒定難度。而利用唾液進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)一步增加了該鑒定的難度。往往需要研究人員經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)和分析，并做針對(duì)性的檢測(cè)環(huán)節(jié)的調(diào)整改變才能得到有效的鑒定結(jié)果。本發(fā)明通過進(jìn)行以下檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)方法(其中的濃縮換液、酶解和除鹽、富集唾液N-糖肽的環(huán)節(jié)尤其進(jìn)行了針對(duì)性的設(shè)計(jì))，也證實(shí)了相應(yīng)的唾液樣本中存在肝腫瘤標(biāo)志物高爾基體蛋白73 (GP73)，另外，發(fā)現(xiàn)還存在癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8(CEA)。( I)處理唾液樣本將采集到的唾液樣本在4°C條件下的離心12000rpmlh,收集上清并使用O. 45 μ m針頭式濾器進(jìn)行過濾；向過濾后的唾液樣本中加入蛋白酶抑制劑(每IOmL加入IyL蛋白酶抑制劑)，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算唾液樣本中的蛋白含量，并將唾液樣本儲(chǔ)存于-80°C冰箱備用。( 2 )唾液蛋白的濃縮換液取包含O. 5mg蛋白的唾液樣本，通過Amicon Ultra-lOK離心超濾器進(jìn)行濃縮，采用變性緩沖液稀釋唾液樣品至蛋白終濃度4g/L得到唾液蛋白溶液；所述變性緩沖液的pH=8. 38，含有8M尿素或者O. 4M NH4HCO3或者O. 1% (體積分?jǐn)?shù))SDS。(3)唾液蛋白的Trypsin酶解和除鹽取O. 5mg唾液蛋白溶液，加入3. 125 μ L_DTT溶液(200mM，用O. IM NH4HCO3溶液配制)，于60°C孵育60min ;然后加入12. 5 μ L碘乙酰胺溶液(200mM，用O. IM NH4HCO3溶液配制)，20°C孵育60min并避光；再次加入3. 125 μ LDTT溶液(200mM，使用O. IM NH4HCO3溶液配制)，60°C孵育60min，去除未反應(yīng)的碘乙酰胺；采用O. IM NH4HCO3溶液稀釋唾液蛋白溶液至尿素濃度小于2M，留存I μ g的蛋白用于SDS-PAGE的檢測(cè)；以50mM鹽酸溶液活化Trypsin，取10 μ g活化的Trypsin與蛋白樣本進(jìn)行反應(yīng)，37°C輕搖過夜；最后12，OOOg離心IOmin除掉未被消化的物質(zhì)；用TFA調(diào)節(jié)酶解后多肽溶液pH至小于3 ;使用S印-Paklcc C18柱對(duì)多肽混合物進(jìn)行除鹽。DTT即二硫蘇糖醇，該步驟中分步加入的二硫蘇糖醇碘乙酰胺二硫蘇糖醇=1:2:1 (摩爾比)。(4)富集唾液N-糖肽對(duì)經(jīng)過酶解和除鹽后的樣品進(jìn)行高碘酸氧化處理，再進(jìn)行除鹽處理，即每個(gè)樣品中加入22. 5 μ LIOOmM高碘酸鈉儲(chǔ)液，在避光條件下于4 °C反應(yīng)60min ;然后加入
I.8ml0. 1%TFA溶液稀釋乙腈濃度并調(diào)節(jié)pH ;使用S印_PakC18柱去除未反應(yīng)的NaI04，最終經(jīng)O. 2mL80%ACN/0. 1%TFA洗脫兩次，獲得樣品溶液；采用以下兩種方法之一進(jìn)行富集唾液N-糖肽(4. I)酰肼化學(xué)方法富集唾液N-糖肽每Img樣品溶液使用50 μ L50%的酰肼樹脂懸液。首先將樹脂于3000rpm離心30s除去溶液；然后用去離子水清洗樹脂2 3次，每次lmL，完成樹脂的預(yù)處理。接著將氧化后的多肽樣品溶液與酰肼樹脂混合，室溫輕搖反應(yīng)4h或過夜，使糖肽與樹脂偶聯(lián)得到富集。最后用50%ACN/0. 1%TFA, I. 5M NaCl,水和O. IM NH4HCO3溶液各清洗樹脂3次，共清洗12次以去除非共價(jià)粘附于樹脂的非糖肽，而糖肽在酰肼樹脂表面得到特異性富集；以50 μ L25mM NH4HCO3緩沖溶液重懸酰肼樹脂，加入3 μ L500U/ μ L的PNGase F(每I毫克樣品使用50 μ L50%的酰肼樹脂懸液，6 μ LPNGase F)，37°C輕搖過夜。3000rpm離心收集上清，然后用100 μ L超純水清洗樹脂兩次,合并清洗液和上清,使用Speed Vac凍干，然后用20 μ L0. 1%甲酸溶液重溶樣品，_20°C保存或直接進(jìn)行LC-MS/MS分析；或者(4. 2)親水親和方法富集唾液N-糖肽每Img樣品溶液使用150 μ L50%的凝膠粒子(Sepharose CL-4B樹脂)。首先將凝膠粒子8000rpm離心5min，去除溶液；然后分別用ImL的去離子水和平衡液(正丁醇乙醇水=5:1:1)各清洗樹脂2遍，完成樹脂預(yù)處理。將除鹽后多肽凍干，以平衡液重新溶解多肽，將其與S^harose CL-4B粒子混合，室溫下輕搖反應(yīng)I. 5h，使糖肽偶聯(lián)于樹脂上；使用平衡液清洗凝膠粒子3次，IOmin/次。最后用200 μ L洗脫液(乙醇水=1 1)洗脫兩次，每次30min。合并洗脫液,使用Speed Vac凍干，用PNGase F進(jìn)行酶解，再次凍干；然后用20 μ L0. 1%甲酸溶液重溶后，_20°C保存或直接進(jìn)行下一步的LC-MS/MS分析。(6) LC-MS/MS 鑒定每次取8 μ I樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析。對(duì)于步驟(5)的兩種富集唾液N-糖肽的方式，也可以綜合兩種方式得到的樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，從而更加準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)中使用安捷倫Q-TOF質(zhì)譜儀(Agilent6530)進(jìn)行LC-MS/MS分析。(7)數(shù)據(jù)庫檢索和糖基化位點(diǎn)分析經(jīng)LC-MS/MS分析得到的LC-MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mascot V2. 3. 02軟件在IPI_human_v3. 74數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，從而檢測(cè)出唾液樣本中是否含有高爾基體蛋白73。多肽鑒定結(jié)果篩選標(biāo)準(zhǔn)單個(gè)多肽得分高于25，P值小于O. 01。將每個(gè)去糖基化樣品的三次LC-MS/MS結(jié)果合并為該次鑒定的總糖肽，三次重復(fù)糖肽富集試驗(yàn)中鑒定到2次以上的多肽可認(rèn)為是該組樣本(肝癌/正常)中鑒定到得多肽。為降低假陽性率，僅將鑒定到含有(N-X-S/T)保守序列且其天冬酰胺(N)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?D)的多肽認(rèn)定為N-糖肽，脫氨基的天冬酰胺為N-糖基化位點(diǎn)。對(duì)于以上實(shí)驗(yàn)過程，我們按照對(duì)比實(shí)驗(yàn)的一般操作規(guī)程進(jìn)行全唾液的采集樣本選取樣本分為肝癌患者和健康志愿者兩組。由于肝癌患者中老年人居多，故選取老年健康志愿者作為對(duì)照組。唾液樣本共采自58名志愿者，經(jīng)放射免疫分析法確診的肝癌患者共27人，從西安市某醫(yī)院肝癌患者中隨機(jī)抽取；老年健康志愿者31人，從西安市某敬老院健康老人中隨機(jī)抽取。唾液采集所有唾液均在非刺激狀態(tài)下采集。志愿者在早飯至少2小時(shí)以后，首先用生理鹽水漱口，然后以舌抵上腭，使唾液自然分泌并收集于滅菌后的離心管中。每位志愿者至少采集2mL唾液，采集后的唾液立即置于冰上保存，并將同組(肝癌或健康)樣本的唾液進(jìn)行等體積混合，以降低個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響；并且在2小時(shí)內(nèi)，將收集到的唾液進(jìn)行步驟(I)的初步處理。檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下表I所示。表I
權(quán)利要求
1.針對(duì)唾液樣本檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的免疫層析試紙條，包括沿層析方向依次設(shè)置的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、以及用于吸收檢測(cè)樣品中多余液體的吸水墊，樣品墊上粘附標(biāo)有指示線的膠帶；其特征在于 所述金標(biāo)墊是吸附有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標(biāo)識(shí)有檢測(cè)帶Tl和質(zhì)控線C ;其中，所述檢測(cè)帶Tl固化有單克隆抗體GP73-2，質(zhì)控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征在于作為金標(biāo)墊的玻璃纖維，還吸附有膠體金標(biāo)記的CEA-I ;在檢測(cè)帶Tl與質(zhì)控線C之間還標(biāo)識(shí)有檢測(cè)帶T2，檢測(cè)帶T2固化有單克隆抗體CEA-2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條，其特征在于檢測(cè)帶Tl、檢測(cè)帶T2、質(zhì)控線C依次相隔2暈米、4暈米。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于以質(zhì)量計(jì)，膠體金標(biāo)記的單克隆抗體CEA-I在金標(biāo)墊上的含量與膠體金標(biāo)記的單克隆抗體GP73-1的含量相同，固化于檢測(cè)帶Tl上的單克隆抗體GP73-2與固化于檢測(cè)帶T2上的單克隆抗體CEA-2的含量相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫層析試紙條，其特征在于 膠體金標(biāo)記的單克隆抗體在金標(biāo)墊上的含量按照以下方式限定所述金標(biāo)墊是將玻璃纖維充分浸泡于濃度為4 10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液所得； 所述濃縮度的倍數(shù)按照以下方式確定120ii g的單克隆抗體與膠體金溶液反應(yīng)，最終得到的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體溶于ImL的PBS溶液中，設(shè)其為10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，較低濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液是采用相同的PBS按照體積比對(duì)其稀釋得到； 固化于檢測(cè)帶上的單克隆抗體含量按照以下方式限定單克隆抗體用O.Olmol/LPH7. 2的PBS稀釋至濃度為I 4mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測(cè)帶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述金標(biāo)墊是將玻璃纖維充分浸泡于濃度為5倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液所得；單克隆抗體用0. 01mol/LPH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測(cè)帶。
7.制備如權(quán)利要求6所述免疫層析試紙條的方法，包括以下環(huán)節(jié) (1)膠體金制備 采用氯金酸溶液制備得到膠體金溶液； (2)膠體金標(biāo)記 將膠體金溶液的PH值調(diào)節(jié)至8. 0，加入單克隆抗體GP73-1和CEA-I各60 y g混勻，兩種單克隆抗體的總濃度為12 ii g/mL ;反應(yīng)后，2000rpm離心,去沉淀,對(duì)上清液12000rpm離心，然后棄上清，沉淀溶于ImL的含0. 2%BSA的0. 01mol/L pH8. 0的PBS溶液中，即為10倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，然后用PBS將其稀釋為5倍濃縮度的膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液，將玻璃纖維在此膠體金標(biāo)記單克隆抗體溶液中充分浸泡后取出，冷凍干燥，得到備用的金標(biāo)墊； (3)抗體包被 單克隆抗體GP73-2和CEA-2分別用0. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL各5mL ;分別依次在NC膜上劃線，使單克隆抗體固化在硝酸纖維素膜上；膜干燥后完全浸泡于含1%BSA的0. 01mol/L pH7. 2的PBS中；然后取出硝酸纖維素膜用PBS清洗，干燥后得到備用的硝酸纖維素膜； (4)試紙條的組裝 樣品墊采用吸水玻璃纖維，吸水墊采用吸水濾紙；將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝構(gòu)成試紙條，并將整個(gè)試紙條貼附于PVC板中央，裁切為適用寬度；然后密封干燥保存?zhèn)溆谩?br> 8.快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法，是取唾液樣本，將權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(T15分鐘后唾液樣本出現(xiàn)在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測(cè)帶以及質(zhì)控線顯色狀態(tài)，得到以下三種檢測(cè)結(jié)果之一 (1)檢測(cè)帶Tl以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73 ； (2)僅質(zhì)控線C顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73； (3)無紫紅色條帶顯現(xiàn)；則表明試紙條失效，該檢測(cè)過程無效。
9.快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法，是取唾液樣本，將權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(T15分鐘后唾液樣本出現(xiàn)在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測(cè)帶以及質(zhì)控線顯色狀態(tài)，得到以下四種檢測(cè)結(jié)果之一 (1)檢測(cè)帶Tl和檢測(cè)帶T2以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8 ； (2)檢測(cè)帶T2以及質(zhì)控線C均顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8; (3)僅質(zhì)控線C顯現(xiàn)，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附因子8; (4)無紫紅色條帶顯現(xiàn)或者檢測(cè)帶Tl顯現(xiàn)而檢測(cè)帶T2不顯現(xiàn)；則該次檢測(cè)無效。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速無損傷性檢測(cè)肝腫瘤標(biāo)志物的方法以及采用的試紙條。采用的試紙條的金標(biāo)墊是吸附有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標(biāo)識(shí)有檢測(cè)帶T1和質(zhì)控線C；其中，所述檢測(cè)帶T1固化有單克隆抗體GP73-2，質(zhì)控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig。檢測(cè)方法為取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，10~15分鐘后唾液樣本出現(xiàn)在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測(cè)帶以及質(zhì)控線顯色狀態(tài)，即得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明通過取唾液樣本作為檢測(cè)對(duì)象，較之于血清樣本以及其他可能的體液樣本，本發(fā)明更易于采集樣本，無創(chuàng)，檢測(cè)準(zhǔn)確、安全簡(jiǎn)便、成本低且易于保存。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102854324SQ201210294440
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者李錚, 趙菲, 王秦哲, 于漢杰, 張華 , 孫士生 申請(qǐng)人:西北大學(xué)