專利名稱：復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬天然藥物篩選領(lǐng)域，具體地說是涉及一種從中藥及天然產(chǎn)物等復(fù)雜天然產(chǎn)物中快速分離制備、分析和活性評(píng)價(jià)的一體化方法，用于復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性化合物的篩選。
背景技術(shù)：
天然產(chǎn)物中含有豐富的具有生物活性的成分，是開發(fā)新藥候選化合物的巨大資源庫(kù)。但是目前針對(duì)天然藥物的開發(fā)并沒有形成如化學(xué)藥物開發(fā)那樣的規(guī)模，其中最大的技術(shù)難度在于天然產(chǎn)物的分離制備與高通量篩選的樣品要求之間存在差距。常規(guī)的植化方法大都采用有機(jī)溶劑對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分離，制得的樣品需要干燥、稱量、溶解、配制、加樣等一系列步驟后才能在微孔板中進(jìn)行高通量篩選，存在耗時(shí)耗力等問題。因此，開發(fā)一種快 速分離制備與活性評(píng)價(jià)緊密結(jié)合的系統(tǒng)可以極大地提高天然藥物中活性化合物發(fā)現(xiàn)的速度。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)天然產(chǎn)物中活性化合物的快速篩選發(fā)現(xiàn)已提出了幾種研究思路，如構(gòu)建多通道逆流色譜與高通量分餾相結(jié)合構(gòu)建的自動(dòng)化組分制備系統(tǒng)，已應(yīng)用于一些中藥復(fù)方的組分快速制備；又如應(yīng)用液相色譜與傅里葉變換質(zhì)譜聯(lián)用，結(jié)合微孔板分光光度計(jì)來篩選柴胡疏肝散中的抗氧化活性成分。這些分離篩選方法，可以提高天然產(chǎn)物中活性成分篩選效率，降低實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分篩選方法，是一種在復(fù)雜天然產(chǎn)物中通過并行分離制備、分析篩選活性成分的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I)樣品并打制備
將待測(cè)樣品(天然產(chǎn)物提取物、中藥提取物或含多種化學(xué)成分的混合物樣品)配制成溶液，分別取10-50 μ L溶液，通過自動(dòng)進(jìn)樣器或手動(dòng)進(jìn)樣器注入并行制備系統(tǒng)，并行制備系統(tǒng)由二元液相色譜泵，5根并行連接的色譜柱以及4臺(tái)餾分收集儀組成(可根據(jù)需求擴(kuò)展)，將其中4根色譜柱的洗脫液，采用4臺(tái)自動(dòng)餾分收集儀分別收集至4塊微孔板，每孔中餾分體積根據(jù)微孔板容積確定。(2)樣品分析
將上述并行制備系統(tǒng)中剩余I根色譜柱的洗脫液通過管線與紫外/可見光檢測(cè)器相連，然后再接入電噴霧一質(zhì)譜儀，對(duì)步驟(I)制備的樣品進(jìn)行定性分析。(3)樣品處理
通過常規(guī)離心濃縮等方法，揮干4塊收集有相同餾分的微孔板中的溶液，再加入一定量溶劑溶解后，作為活性評(píng)價(jià)的待測(cè)樣品。(4)活性評(píng)價(jià)
在微孔板上，采用基于細(xì)胞、酶或者化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法對(duì)微孔板中各孔對(duì)應(yīng)的餾分的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其中具有顯著活性的餾分?；诩?xì)胞的活性評(píng)價(jià)方法包括腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)試、損傷的內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞活力測(cè)試等，可用于評(píng)價(jià)餾分的抗腫瘤、內(nèi)皮保護(hù)及心肌保護(hù)活性?；诿傅幕钚栽u(píng)價(jià)方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶等酶活力測(cè)試，可用于評(píng)價(jià)餾分的酶抑制活性；基于化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法包括自由基清除活力測(cè)試，可用于評(píng)價(jià)餾分的抗氧化活性。(5)活性成分篩選
綜合處理液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析數(shù)據(jù)和活性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，確定活性餾分在液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析圖譜中的位置，并進(jìn)一步提取與該餾分相對(duì)應(yīng)的化合物的紫外光譜、分子量、分子碎片等化學(xué)信息，推斷活性化合物結(jié)構(gòu)，篩選出活性成分。通過制備純化目標(biāo)化合物或購(gòu)買目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品等方式，獲取活性成分，再采用活性評(píng)價(jià)方法驗(yàn)證目標(biāo)化合物的藥效活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在復(fù)雜天然產(chǎn)物中篩選活性成分中的應(yīng)用。所述復(fù)雜天然產(chǎn)物包括天然產(chǎn)物提取物、中藥提取物或含多種化學(xué)成分的混合物。 本發(fā)明應(yīng)用多通道高效液相色譜作為分離單元、質(zhì)譜作為聯(lián)用的檢測(cè)分析單元、各型號(hào)孔板自動(dòng)餾分收集儀作為收集單元與藥效活性評(píng)價(jià)單元，上述單元構(gòu)成了一體化的天然產(chǎn)物分離分析與活性快速篩選系統(tǒng)。/可見光檢測(cè)器相連然后與電噴霧質(zhì)譜儀相連，構(gòu)成一體化的分離分析檢測(cè)系統(tǒng)；從高效液相泵分出來的另一路管線與多個(gè)進(jìn)樣器相連后與多通道并行的色譜柱連接作為并行分離系統(tǒng)，然后通過毛細(xì)管與各型號(hào)孔板自動(dòng)餾分收集儀連接作為自動(dòng)收集系統(tǒng)，在本系統(tǒng)進(jìn)行分離制備后可一次得到多塊孔板，可進(jìn)一步進(jìn)行基于細(xì)胞、酶或者化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)，活性篩選數(shù)據(jù)又可以與分析檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析得到活性化合物信息，實(shí)現(xiàn)了分離制備、分析檢測(cè)與活性篩選的連貫結(jié)合。[51]
本發(fā)明提供了一種針對(duì)復(fù)雜樣品的并行分離制備、分析和自動(dòng)收集方法，使之具有能與藥效活性篩選連貫結(jié)合的特點(diǎn)，具有快速分離、自動(dòng)收集和活性快速篩選結(jié)合等顯著優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于采用5通道并行液相色譜進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離，并能夠?qū)悠分苯又苽涞狡ヅ涞奈⒖装逯?，用于活性快速篩選。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)與藥效活性篩選連貫結(jié)合，具有快速分離、自動(dòng)收集和與藥效篩選緊密結(jié)合等顯著優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離制備與分析，通過與基于微孔板的活性快速篩選方法相結(jié)合，能夠快速得到樣品中活性成分并進(jìn)行鑒定，相比于傳統(tǒng)的分離制備然后活性篩選的方法有速度快、成本低、信息量豐富、樣品要求低等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明采用多通道并行液相色譜進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離，并能夠?qū)⒔?jīng)液相色譜分離的餾分直接收集到相匹配的微孔板中，制備出微量組分，用于活性快速篩選；在制備的同時(shí)能夠?qū)μ烊划a(chǎn)物進(jìn)行分析，從而通過分子量等鑒定潛在的活性化合物，因此具有高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為并行制備、分析與活性快速篩選系統(tǒng)基本原理圖。圖2為桑葉提取物中抗氧化活性成分篩選結(jié)果圖。圖3為冬凌草提取物中抗腫瘤活性成分篩選結(jié)果圖。圖4為七個(gè)化合物混合樣品溶液中抗氧化活性成分篩選結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明的整個(gè)系統(tǒng)由多通道高效液相色譜作為分離單元、質(zhì)譜作為聯(lián)用的檢測(cè)分析單元、各型號(hào)孔板自動(dòng)餾分收集儀作為收集單元與藥效活性評(píng)價(jià)單元，整個(gè)系統(tǒng)可由計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)被分離樣品的光譜與質(zhì)譜信號(hào)的自動(dòng)采集分析。自動(dòng)餾分收集系統(tǒng)和離心濃縮系統(tǒng)設(shè)置可需要根據(jù)不同樣品的色譜條件進(jìn)行相應(yīng)的更改。完成活性測(cè)試后，將得到的活性數(shù)據(jù)與光譜、質(zhì)譜等化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照吻合分析，可以快速分析得到復(fù)雜天然產(chǎn)物混合物中具有相應(yīng)藥理活性的化合物。實(shí)施例I
參見圖1，本系統(tǒng)由5通道高效液相色譜分離單元、4臺(tái)96孔板自動(dòng)餾分收集單元、I臺(tái) 質(zhì)譜儀組成、I臺(tái)離心濃縮儀和活性篩選系統(tǒng)組成。該并行分離制備、分析快速篩選活性成分的方法，可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I)樣品并打制備
將天然產(chǎn)物提取物、中藥提取物或含多種化學(xué)成分的混合物樣品用50%甲醇一水(體積比)溶液，配成25mg/mL濃度的樣品，分別取20 μ L溶液，通過Agilent 1100液相色譜的自動(dòng)進(jìn)樣器及4個(gè)D-14163手動(dòng)進(jìn)樣器(德國(guó)Knauer公司)注入并行制備系統(tǒng)。并行制備系統(tǒng)由Agilent 1100 二元液相色譜泵,5根并行連接的Zorbax SB C18色譜柱(4. 6mm*250mm，
5μ m粒徑)以及4臺(tái)FoxyRl懼分收集儀(美國(guó)Teledyne公司)組成。將其中4根色譜柱的洗脫液，采用自動(dòng)餾分收集儀分別收集至4塊96孔板(Corning公司)中。液相色譜的流動(dòng)相條件為流動(dòng)相為O. 05%甲酸-水與乙腈溶液，流速為O. 4 mL/min,進(jìn)樣量為20 μ L，柱溫為 30°C。洗脫梯度0-20 min，乙腈(20%-60%) ;20-21 min，乙腈(60%_80%) ;21_35 min,乙臆(80%—95%) ο(2)樣品分析
將上述并行制備系統(tǒng)中，剩余I根色譜柱的洗脫液通過管線與Agilent 1100型光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD檢測(cè)器)相連，然后再接入Finnigan LCQ Deca XPplus型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀，對(duì)步驟(I)制備的樣品進(jìn)行定性分析。DAD檢測(cè)器檢測(cè)范圍為190-400nm;質(zhì)譜條件為鞘氣(氮?dú)?，輔助氣(氮?dú)?，裂解電壓為3.5 KV，離子源溫度為350 °C，掃描質(zhì)荷比范圍為100-1000m/z。(3)樣品處理
將步驟I制備得到的4塊96孔板，采用SpeedVac離心濃縮儀(美國(guó)ThermoElectron,公司)離心濃縮儀，冷凍濃縮2小時(shí)揮干溶劑。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液，溶解后作為待測(cè)樣品。(4)活性評(píng)價(jià)
在96板上，采用基于細(xì)胞、酶或者化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法對(duì)各孔對(duì)應(yīng)的餾分的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其中具有顯著活性的餾分。采用的活性評(píng)價(jià)模型包括但不限于抗氧化活性評(píng)價(jià)、抗腫瘤細(xì)胞增殖活性評(píng)價(jià)、alpha-葡萄糖苷酶抑制活性評(píng)價(jià)、脂肪酶抑制活性評(píng)價(jià)。基于酶的活性評(píng)價(jià)方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶等酶活力測(cè)試，可用于評(píng)價(jià)餾分的酶抑制活性；基于化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法包括自由基清除活力測(cè)試，可用于評(píng)價(jià)餾分的抗氧化活性。
(5)活性成分發(fā)現(xiàn)
綜合處理液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析數(shù)據(jù)和活性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，確定活性餾分在液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析圖譜中的位置，采用Xcalibur軟件(美國(guó)Thermo公司)進(jìn)一步提取與該餾分相對(duì)應(yīng)的化合物的紫外吸收光譜、分子量等信息，推斷活性化合物結(jié)構(gòu)，篩選出活性成分。通過制備純化目標(biāo)化合物或購(gòu)買目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品等方式，獲取活性成分，再采用活性評(píng)價(jià)方法驗(yàn)證目標(biāo)化合物的藥效活性。實(shí)施例2本發(fā)明方法在桑葉提取物中篩選抗氧化活性成分中的應(yīng)用
桑葉提取物制備250 g藥材，用70%乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)后用DlOl大孔樹脂純化以后，再過聚酰胺純化，50%的乙醇沖洗下來的樣品，濃縮至干燥后，再用50%甲醇-水復(fù)溶至25 mg/mL,配置好的溶液混勻后離心(10000 rpm, 10 min),取上清液減壓濃縮干燥后作為并行制備樣品。按以下步驟進(jìn)行活性化合物發(fā)現(xiàn)
(I)樣品并行制備將桑葉提取物用50%甲醇一水(體積比)溶液，配成25mg/mL濃度 的樣品，分別取20 μ L溶液，通過Agilent 1100液相色譜的自動(dòng)進(jìn)樣器及4個(gè)D-14163手動(dòng)進(jìn)樣器(德國(guó)Knauer公司)注入并行制備系統(tǒng)。并行制備系統(tǒng)由Agilent 1100 二元液相色譜泵，5根并行連接的Zorbax SB C18色譜柱(4. 6mm*250mm，5 μ m粒徑)以及4臺(tái)FoxyRl餾分收集儀(美國(guó)Teledyne公司)組成。將其中4根色譜柱的洗脫液，采用自動(dòng)餾分收集儀分別收集至4塊96孔板(Corning公司)中。色譜條件為流動(dòng)相為O. 05%甲酸-水與乙腈溶液，流速為O. 4 mL/min，進(jìn)樣量為20 yL，柱溫為30°C。洗脫梯度0-20 min，乙腈(20%-60%) ；20-21 min，乙腈(60%-80%) ;21_35 min，乙腈(80%_95%)。(2)樣品分析將上述并行制備系統(tǒng)中，剩余I根色譜柱的洗脫液通過管線與Agilent 1100型光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD檢測(cè)器)相連，然后再接入Finnigan LCQDeca XPplus型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀，對(duì)步驟(I)制備的樣品進(jìn)行定性分析。DAD檢測(cè)器檢測(cè)范圍為190-400nm ;質(zhì)譜條件為鞘氣(氮?dú)?，輔助氣(氮?dú)?，裂解電壓為3.5 KV，離子源溫度為350 °C，掃描質(zhì)荷比范圍為lOO-lOOOm/z。(3)樣品處理將步驟I制備得到的4塊96孔板，采用SpeedVac離心濃縮儀(美國(guó)Thermo Electron,公司)離心濃縮儀,冷凍濃縮2小時(shí)揮干溶劑。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液,溶解后作為待測(cè)樣品。(4)抗氧化活性評(píng)價(jià)采用DPPH法測(cè)定96孔板中桑葉各餾分的抗氧化活性。在樣品板中10個(gè)空白孔內(nèi)加入維生素C作為陽性藥，再每孔加入100 yL水和100 μ L DPPH的乙醇溶液(500 ymol/L)，震蕩孵育I h (700 rpm, 37 V)。然后采用ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定空白對(duì)照板和樣品板的吸光度,并計(jì)算DPPH的清除率清除率(%) = [I- (ODsample - ODblank) / ODcontro1 Γ100。(0D_tMl 是陰性對(duì)照樣吸光值(溶劑+ DPPH) ;0Dsample是樣品吸光值；ODblank是空白對(duì)照吸光值(純?nèi)軇?)。(5)活性化合物發(fā)現(xiàn)結(jié)果參見附圖2，圖中共有六個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的餾分具有顯著的DPPH清除作用，其清除率均高于40%。通過分析液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析數(shù)據(jù)，得到各色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物分別為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、陸地棉苷和煙花苷，其質(zhì)譜碎片信息和分子離子峰數(shù)據(jù)如表I所示。結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)化合物均具有較好的抗氧化活性。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分篩選方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)樣品并打制備 將待測(cè)樣品配制成溶液，分別取10-50 μ L溶液，通過自動(dòng)進(jìn)樣器或手動(dòng)進(jìn)樣器注入并行制備系統(tǒng)，所述的并行制備系統(tǒng)由ニ元液相色譜泵，5根并行連接的色譜柱以及4臺(tái)餾分收集儀組成，將其中4根色譜柱的洗脫液，采用4臺(tái)自動(dòng)餾分收集儀分別收集至4塊微孔板，每孔中餾分體積根據(jù)微孔板容積確定； (2)樣品分析 將上述并行制備系統(tǒng)中剰余I根色譜柱的洗脫液通過管線與紫外/可見光檢測(cè)器相連，然后再接入電噴霧一質(zhì)譜儀，對(duì)步驟(1)制備的樣品進(jìn)行定性分析； (3)樣品處理 通過離心濃縮方法，揮干4塊收集有相同餾分的微孔板中的溶液，再加入溶劑溶解后，作為活性評(píng)價(jià)的待測(cè)樣品； (4)活性評(píng)價(jià) 在微孔板上，采用基于細(xì)胞、酶或者化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法對(duì)微孔板中各孔對(duì)應(yīng)的餾分的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選其中具有顯著活性的餾分； (5)活性成分篩選 綜合處理液相色譜ー質(zhì)譜聯(lián)用分析數(shù)據(jù)和活性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，確定活性餾分在液相色譜ー質(zhì)譜聯(lián)用分析圖譜中的位置，并進(jìn)ー步提取與該餾分相對(duì)應(yīng)的化合物的紫外光譜、分子量、分子碎片等化學(xué)信息，推斷活性化合物結(jié)構(gòu)，篩選出活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為天然產(chǎn)物提取物、中藥提取物或含多種化學(xué)成分的混合物樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述基于細(xì)胞的活性評(píng)價(jià)方法包括腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)試、損傷的內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞活力測(cè)試，用于評(píng)價(jià)餾分的抗腫瘤、內(nèi)皮保護(hù)及心肌保護(hù)活性；基于酶的活性評(píng)價(jià)方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、こ酰膽堿酯酶等酶活力測(cè)，用于評(píng)價(jià)餾分的酶抑制活性；基于化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方法包括自由基清除活力測(cè)試，用于評(píng)價(jià)餾分的抗氧化活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(5)通過制備純化目標(biāo)化合物或購(gòu)買目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品等方式，獲取活性成分，再采用活性評(píng)價(jià)方法驗(yàn)證目標(biāo)化合物的藥效活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法在復(fù)雜天然產(chǎn)物中篩選活性成分中的應(yīng)用，所述復(fù)雜天然產(chǎn)物包括天然產(chǎn)物提取物、中藥提取物或含多種化學(xué)成分的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分快速篩選方法，采用多通道高效液相色譜作為分離單元、質(zhì)譜作為聯(lián)用的檢測(cè)分析單元、各型號(hào)孔板自動(dòng)餾分收集儀作為收集單元與藥效活性評(píng)價(jià)單元，構(gòu)成一體化的天然產(chǎn)物分離分析與活性快速篩選系統(tǒng)，可一次得到多塊孔板，可進(jìn)一步進(jìn)行基于細(xì)胞、酶或者化學(xué)反應(yīng)的活性評(píng)價(jià)，活性篩選數(shù)據(jù)又可以與分析檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析得到活性化合物信息，實(shí)現(xiàn)了分離制備、分析檢測(cè)與活性篩選的連貫結(jié)合。本發(fā)明具有快速分離、自動(dòng)收集和與藥效篩選緊密結(jié)合等顯著優(yōu)點(diǎn)，具有速度快、成本低、信息量豐富、樣品要求低等優(yōu)勢(shì)?？捎糜趶?fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分的篩選。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102818868SQ20121030702
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者程翼宇, 王毅, 張玉峰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)