專(zhuān)利名稱(chēng)：一種熒光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖的試劑盒，特別涉及利用濾紙干血片中的總半乳糖與NAD反應(yīng)生成熒光物質(zhì)NADH的原理，快速檢測(cè)新生兒體內(nèi)總半乳糖濃度水平的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)新生兒足跟血干血片樣品中的總半乳糖濃度水平進(jìn)行快速判斷，從而輔助新生兒半乳糖血癥的確診。
背景技術(shù)：
新生兒半乳糖血癥(galactosemia),是臨床上較為常見(jiàn)的一種染色體隱性遺傳代謝病。是由于半乳糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖的代謝途徑中相關(guān)酶的先天性缺陷導(dǎo)致半乳糖正常代謝 途徑受阻，體內(nèi)的半乳糖通過(guò)焦磷酸酶旁路途徑、半乳糖醇及半乳糖酸途徑等代謝半乳糖，從而使得半乳糖及其旁路代謝產(chǎn)物堆積引起半乳糖血癥。目前已知有三種酶缺乏會(huì)造成新生兒代謝障礙，分別是半乳糖激酶(galactokinase)、半乳糖-I-憐酸尿昔酸轉(zhuǎn)移酶(galactose-l-phosphateuridyl transferase)及尿苷二憐酸半乳糖-4-異構(gòu)酶(UDP galactose-4-epimerase),其中以半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶缺失為經(jīng)典乳糖血癥。新生兒體內(nèi)由于半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的缺失，從而阻斷體內(nèi)半乳糖代謝，導(dǎo)致半乳糖以及中間產(chǎn)物半乳糖-I-磷酸積聚，進(jìn)而侵犯新生兒肝、腎、腦等身體器官，嚴(yán)重時(shí)新生兒在嬰幼兒時(shí)不能存活。目前，該代謝缺陷病在歐美人群中發(fā)病率約為1/30000，我國(guó)發(fā)病率較低，但近年來(lái)也呈上升趨勢(shì)。由于半乳糖血癥的臨床表現(xiàn)并無(wú)特異性，所以其診斷較多地依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室檢查，目前實(shí)驗(yàn)室常用的診斷方法有酶學(xué)檢測(cè)以及代謝產(chǎn)物檢測(cè)。酶學(xué)檢測(cè)發(fā)展起始于1966年，主要方法為Beutler實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介檢測(cè)紅細(xì)胞中GALT酶活性的方法。該方法的原理在于若GALT活性正常，在全血或者血濾紙片中加入混有尿苷-二磷酸葡糖、半乳糖-I-磷酸(Gal-I-P)、三磷酸吡啶核苷酸(TPN)混合物，孵育一段時(shí)間后，生成的α-I-磷酸葡糖在變位酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)存在的情況下可以將氧化型TPN可以還原成還原型的ΤΡΝ，后者在波長(zhǎng)為465 μ m的紫外燈的激發(fā)下產(chǎn)生熒光。此方法雖簡(jiǎn)單易操作，并且是診斷半乳糖血癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但相關(guān)研究表明，溫度及濕度過(guò)高均會(huì)引起假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)該診斷方法依賴(lài)于G6H)的存在，G6PD的缺陷同樣出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。代謝產(chǎn)物檢測(cè)半乳糖血癥的直接表現(xiàn)是機(jī)體或體液中異常高濃度的半乳糖及旁路代謝產(chǎn)物(主要是半乳糖-I-磷酸)的積聚，因而目前常根據(jù)檢測(cè)新生兒體內(nèi)的代謝產(chǎn)物濃度來(lái)進(jìn)行半乳糖血癥的診斷。現(xiàn)階段，對(duì)半乳糖代謝產(chǎn)物的檢測(cè)常采用細(xì)菌抑制法、串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相-液相色譜法以及熒光分析法等手段。其中細(xì)菌抑制法因涉及細(xì)菌的培養(yǎng)，對(duì)采血要求較高，同時(shí)細(xì)菌老化、噬菌體和細(xì)菌含量比例，以及突變株穩(wěn)定性均影響診斷結(jié)果，故不建議采用。串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相-液相色譜法對(duì)技術(shù)要求較高，且成本較高、不易于操作，亦不適宜大規(guī)模篩查工作。熒光分析法是現(xiàn)階段疾病篩查常用的一種方法，主要是利用某些物質(zhì)受紫外光或可見(jiàn)光照射激發(fā)后，能發(fā)出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)熒光的特性的一種定性、定量分析方法。熒光分析是一種較為先進(jìn)的分析方法，它比質(zhì)譜法、光譜法等應(yīng)用更為普及。熒光分析法的最大特點(diǎn)是靈敏度高，比分光光度法的靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)；其次選擇性強(qiáng)；最后操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成對(duì)相對(duì)低廉。有利于大規(guī)模疾病篩查工作的順利進(jìn)行。本發(fā)明人利用熒光分析法技術(shù)發(fā)明一種熒光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖的試劑盒，應(yīng)用于新生兒體內(nèi)半乳糖及旁路代謝產(chǎn)物半乳糖-I-磷酸的總量檢測(cè)，輔助于新生兒半乳糖血癥的診斷。國(guó)內(nèi)目前現(xiàn)有的對(duì)新生兒半乳糖血癥的實(shí)驗(yàn)室診斷，通常利用尿液作為檢測(cè)樣本，但尿液并不能真實(shí)反映新生兒體內(nèi)總半乳糖含量，同時(shí)其不便于運(yùn)輸和保存，使新生兒篩查工作復(fù)雜，同時(shí)成本增加。與現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明采用濾紙干血片為載體，采集新生兒足跟血，滴制血片，晾干。與常規(guī)新生兒篩查項(xiàng)目標(biāo)本一致，無(wú)需另外采集，減輕篩查工作 負(fù)擔(dān)。同時(shí)新生兒總半乳糖在濾紙干血片中(2-8) °C中穩(wěn)定性好，活性不易下降，更適合于臨床應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒作為國(guó)內(nèi)首個(gè)新生兒總半乳糖定量測(cè)定的試劑盒，選用新生兒足跟血濾紙干血片為檢測(cè)樣本，并整合熒光分析法，其性能達(dá)到并超過(guò)對(duì)照同類(lèi)雷勃公司的進(jìn)口半乳糖血癥檢測(cè)試劑盒，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)高效、成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用熒光分析技術(shù)進(jìn)行新生兒總半乳糖定量測(cè)定的試劑盒。其基本原理是利用機(jī)體中總半乳糖(游離半乳糖+半乳糖-I-磷酸酶解半乳糖)在GDH催化下與NAD反應(yīng)轉(zhuǎn)變成半乳糖內(nèi)酯，同時(shí)伴隨發(fā)生NAD減少，NADH(可發(fā)熒光)增加的原理，依據(jù)波長(zhǎng)355nm激發(fā)光和波長(zhǎng)460nm發(fā)射光下NADH熒光強(qiáng)度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而對(duì)新生兒體內(nèi)總半乳糖含量進(jìn)行定量測(cè)定。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案I)根據(jù)和對(duì)照同類(lèi)進(jìn)口試劑盒進(jìn)行臨床測(cè)值比較，對(duì)試劑盒所使用的原料進(jìn)行篩選，從而確定最佳的原料，這一篩選過(guò)程包括校準(zhǔn)品配制原料純度、校準(zhǔn)品配制基質(zhì)、堿性磷酸酶(AFOS)使用濃度、半乳糖脫氫酶(GDH)使用濃度、氧化型輔酶I (NAD)使用濃度、白色遮光反應(yīng)板的本底及變異大小。2)確定試劑盒的組分及配方，包括反應(yīng)緩沖液配方、銅試劑配方等，并公開(kāi)了堿性磷酸酶(AFOS)稀釋液和半乳糖脫氫酶(GDH)稀釋液配方。I)本發(fā)明提供的一種熒光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖試劑盒，包括(I)校準(zhǔn)品濾紙干血片、質(zhì)控品濾紙干血片、透明反應(yīng)板、白色遮光反應(yīng)板、反應(yīng)緩沖液、堿性磷酸酶(AFOS)凍干品、半乳糖脫氫酶(GDH)凍干品、氧化型輔酶I (MD)凍干品、銅試劑，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶、板、片的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，校準(zhǔn)品濾紙干血片和質(zhì)控品濾紙干血片由半乳糖-I-磷酸溶解在校準(zhǔn)品和質(zhì)控品基質(zhì)中，并滴制在市售濾紙上。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品濾紙干血片根據(jù)半乳糖-I-磷酸濃度不同分別編號(hào)A-F和Cl、C2，其中半乳糖-I-磷酸可使用市售產(chǎn)品，市售濾紙優(yōu)選Whatman903#濾紙。編號(hào)A-F的校準(zhǔn)品濾紙干血片和C1-C2的質(zhì)控品干血片加入半乳糖-I-磷酸如下表所示
權(quán)利要求
1.一種突光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖(Total Galactose)的試劑盒,試劑盒包括分別裝有反應(yīng)緩沖液、銅試劑、堿性磷酸酶(AFOS)凍干品、氧化型輔酶I (NAD)凍干品、半乳糖脫氫酶(GDH)凍干品并加蓋封密的多個(gè)試劑瓶，五塊96孔透明反應(yīng)板、五塊96孔白色遮光反應(yīng)板、五套校準(zhǔn)品濾紙干血片、五套質(zhì)控品濾紙干血片，和分隔并集中包裝這些試劑瓶、板、片的包裝盒，其特征還在于對(duì)新生兒足跟血濾紙干血片樣品中的總半乳糖濃度水平進(jìn)行快速檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于反應(yīng)緩沖液由Tris-HCl(lOOmmol/L，ρΗ8· 6)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于銅試劑由CuSO4(I. 5mmol/L)、Na2CO3(62. 5mmol/L)與 KNaC4H4O6 · 4H20(lmmol/L)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于堿性磷酸酶(AFOS)凍干品的濃度為25U/ml、稀釋液組分為 Tris-HCl (1 Ommol/T,, pH8. O)、MgCL2 · 6H2O(lmmol/L) >KCl (50mmol/L);氧化型輔酶I (NAD)凍干品的濃度為150mg/ml、溶劑為水溶液；半乳糖脫氫酶(GDH)凍干品的濃度為 6U/ml、稀釋液組分為(NH4)2SO4 (2. 2mol/L)、EDTA(O. 8mmol/L)、BSA(O. 02% )，pH =6· O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于校準(zhǔn)品濾紙干血片制備方法為脫纖維綿羊全血，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌6次后調(diào)整紅細(xì)胞壓積至O. 55，加入半乳糖-I-磷酸原料，配制不同濃度的校準(zhǔn)品，60 μ I/滴滴到Whatman903#濾紙上，濾紙應(yīng)平放室內(nèi)自然晾干，2-8°C保存，各點(diǎn)校準(zhǔn)品濃度如下_半乳糖(mg/dl) AO B5 C10 D20 E40_F_60_
6.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于質(zhì)控品濾紙干血片制備方法為脫纖維綿羊全血，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌6次后調(diào)整紅細(xì)胞壓積至0. 55，加入半乳糖-I-磷酸原料，配制不同濃度的校準(zhǔn)品，60 μ I/滴滴到Whatman903#濾紙上，濾紙應(yīng)平放室內(nèi)自然晾干，2-8°C保存，各點(diǎn)校準(zhǔn)品濃度如下_半乳糖(mg/dl)Cl6(4. 2-7. 8) C2 15.5(10.85-20. 15)
7.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于采用樣本類(lèi)型為新生兒足跟血濾紙干血片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光分析法定量測(cè)定新生兒總半乳糖的試劑盒，特別涉及利用濾紙干血片中的總半乳糖與NAD反應(yīng)生成熒光物質(zhì)NADH的原理，快速檢測(cè)新生兒體內(nèi)總半乳糖濃度水平的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)新生兒足跟血干血片樣品中的總半乳糖濃度水平進(jìn)行快速判斷，從而輔助新生兒半乳糖血癥的確診。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102816833SQ201210309949
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者李明, 李慶, 吳英松, 程林, 董志寧, 程鋼, 何蘊(yùn)韶 申請(qǐng)人:廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司