專利名稱：一種精氨酸含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種物質(zhì)含量的測定方法，特別涉及一種精氨酸含量的測定方法，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精氨酸是一種α氨基酸，亦是20種普遍的天然氨基酸之一。精氨酸可以顯著提高耐力，劉慧莉等人研究顯示長期補充精氨酸可以提高骨骼肌中NO含量，增加肌糖原儲量，延長運動時間，提高運動耐力。目前精氨酸的相關(guān)制劑及原料的檢測方法主要以滴定、旋光或衍生化為主。中國藥典、日本藥典、美國藥典采用高氯酸滴定精氨酸原料，英國藥典、歐洲藥典采用鹽酸滴定精氨酸原料，上述5種藥典采用滴定法，專屬性不強，容易受雜質(zhì)干擾影響含
量結(jié)果。日本藥典、中國藥典對精氨酸注射液中精氨酸的含量檢測采用旋光度法，旋光度法專屬性也不強，容易受有旋光的雜質(zhì)干擾而影響含量測定結(jié)果。美國藥典中記載精氨酸膠囊中精氨酸的含量檢測方法為采用辛烷磺酸鈉為離子對試劑，用高效液相色譜法檢測膠囊中精氨酸含量，該方法雖然專屬性強于滴定方法，但對色譜柱傷害較大，離子對試劑會對色譜柱造成不可逆的傷害，離子對試劑和固定相結(jié)合產(chǎn)生不可逆吸附，進而影響固定相活性位點。比如十八烷基硅膠鍵合色譜柱，離子對試劑會影響色譜柱鍵合，從而達到分析樣品的作用，這種反應(yīng)對色譜柱影響很大，而且離子對試劑很難從色譜柱上沖洗干凈，會大大縮短色譜柱的使用壽命。

另外，采用離子對試劑，容易造成實驗條件不穩(wěn)定。離子對試劑的濃度與其樣品的保留時間有直接的影響，而且離子對試劑對PH值比較敏感，配制流動相時要求精確度較高，否則直接影響實驗的重復(fù)性和重現(xiàn)性。中國藥典中記載精氨酸片中精氨酸的含量測定方法為衍生化方法，以2，4-二硝基氟苯乙腈為衍生化試劑，經(jīng)過避光衍生化反應(yīng)，稀釋，注入色譜儀檢測含量，衍生化反應(yīng)雖然也提高專屬性，但衍生化反應(yīng)容易損壞色譜柱，縮短色譜柱使用壽命，衍生化反應(yīng)容易受衍生化試劑用量、種類、衍生化時間、溫度等條件影響，方法的精密度、準確度、重現(xiàn)性等容易受到影響。中國專利申請?zhí)枮?01010513639.1的專利文件公開了在線衍生測定氨基酸含量的方法，該方法同樣具有衍生化反應(yīng)的缺點，損害色譜柱，方法的精密度、準確度、重現(xiàn)性等容易受到諸多條件的影響等等。王潤玲等人在《高效液相色譜法測定布洛芬精氨酸鹽的含量》一文中公開了布洛芬精氨酸鹽含量檢測方法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(YWG-C18 4. 6X250mm )；以磷酸二氫鈉380mg與磷酸氫二鈉50mg，加水溶解成IOOOml，用磷酸調(diào)pH至3. 0，取出250ml加甲醇750ml，作為流動相；檢測波長為220nm;流速lml/ min ;進樣20μ1。根據(jù)該方法采用DAD檢測器進行驗證，配置布洛芬的對照溶液、精氨酸的對照溶液、布洛芬精氨酸的供試品溶液，檢測波長選擇199nm(精氨酸的最大吸收)、220nm，將上述溶液按照公開的液相條件注入色譜儀，發(fā)現(xiàn)精氨酸在色譜柱基本無保留，與溶劑峰重疊。布洛芬的PKa為5. 2，在pH3. O條件下，布洛芬精氨酸鹽分解為布洛芬和精氨酸，精氨酸極性很強，在C18色譜柱上基本無保留，另外，精氨酸在220nm處基本無吸收，王等人公開的方法在220nm條件下檢測，其實只是檢測布洛芬的含量，掩蓋了精氨酸檢測不到的事實。莊苒在《柱前衍生化HPLC法測定復(fù)方布洛芬緩釋膠囊中精氨酸的含量》一文中公開了精氨酸的含量檢測方法，該方法仍然采用衍生化試劑對精氨酸進行含量測定。中國專利申請?zhí)枮?01010297845. 3的專利文件公開了應(yīng)用氨基柱采用高效液相色譜法測定精氨酸的含量，該方法具有較強的專屬性，但采用氨基柱容易引起精氨酸的拖尾，即引起對稱因子偏小，也就是不對稱因子偏大，另外，采用該流動相條件，氨基柱容易受到損害，縮短使用壽命。由于目前精氨酸含量的測定方法專屬性不強，容易受雜質(zhì)干擾影響含量結(jié)果，而且易損害色譜柱，方法的精密度、準確度、重現(xiàn)性等易受到諸多條件的影響等等，存在一定局限性和弊端所以急需一種新的精氨酸含量的測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷提供一種精氨酸含量的測定的方法，該方法操作簡單、專屬性強、準確度高。本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種精氨酸含量的測定方法，它應(yīng)用氰基柱采用高效液相色譜法對精氨酸進行含量測定。上述含量的測定方法，采用高效液相色譜法所用的流動相為乙腈和磷酸鹽溶液，所述磷酸鹽溶液與乙腈的體積比為10 90 60 :40，優(yōu)選25 75 35 :65。上述含量的測定方法，所述磷酸鹽溶液，其中磷酸鹽選自磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種，濃度為5-100mmol/L，所述磷酸鹽溶液中加入體積百分比為O. 1%-5%的三乙胺、氨水、二乙胺、乙二胺中的一種或幾種。上述含量的測定方法，所述磷酸鹽溶液的pH為2. O 7. 0，優(yōu)選3. O 4. 5。上述含量的測定方法，檢測波長為199nm，柱溫為25 45°C，流速為O. 5 2. Oml/min。不同于以往的精氨酸含量的測定方法，本發(fā)明采用一種新穎的檢測方法，創(chuàng)造性的提供一種操作簡單、專屬性強、準確度高的方法，該方法不同于各國藥典及相關(guān)專利及文獻中公開的含量測定方法。本專利發(fā)明人在采用氰基柱對精氨酸進行含量測定時，發(fā)現(xiàn)直接以乙腈-水為流動相，對供試品和對照品進行液相檢測，在最大吸收波長條件下，在2個小時內(nèi)無明顯色譜峰出現(xiàn)，氰基柱基線一直很平，重復(fù)三針均無色譜峰出現(xiàn)。本文以中國專利申請?zhí)枮?01010297845. 3的專利文件為對比文獻，也進行了對比研究，發(fā)現(xiàn)采用氨基柱，到一定時間后發(fā)現(xiàn)色譜圖上基線上揚，出現(xiàn)很大的鼓包，峰型極其不好，理論板數(shù)趨于零。
分析原因可能為采用氰基柱時，以乙腈-水為流動相系統(tǒng)，色譜柱鍵合氰基的硅膠封尾不完全，硅膠上部分裸露的羥基在流動相為乙腈-水的環(huán)境下與氨基酸的氨基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致精氨酸直接吸附在色譜柱上而不出峰。采用氨基柱時，在乙腈-水的流動相系統(tǒng)條件下，氨基酸的羧酸直接與氨基柱上的氨基鍵合成鹽而造成峰型極其不好。經(jīng)過對氨基柱、氰基柱的分離原理分析、鍵合硅膠的性質(zhì)研究、精氨酸的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)研究以及大量的科學(xué)試驗，本專利發(fā)明人巧妙的解決了氰基柱吸附精氨酸的現(xiàn)象。當采用氰基柱時，采用流動相中的銨離子封閉色譜柱上硅膠上部分裸露的羥基，從而防止氨基酸的氨基與羥基結(jié)合，影響色譜峰峰型。但采用氨基柱時，雖然采用對比文獻加入磷酸氫二銨，并調(diào)整溶液的pH，使銨離子封閉硅膠上部分裸露的羥基，氫離子封閉色譜柱上的氨基，但仍然無法完全防止精氨酸的氨基和羧基與色譜柱反應(yīng)結(jié)合，而影響色譜峰峰型，采用對比文獻的方法精氨酸的色譜峰對稱因子偏小，即不對稱因子偏大，造成該現(xiàn)象就是由于精氨酸仍然與氨基柱吸附引起的。采用新的色譜條件后，采用氰基柱，精氨酸的色譜峰出峰良好，理論板數(shù)、對稱因子、保留時間等參數(shù)均能滿足含量測定要求，因而能實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。


圖1是序號11的液相色譜 圖2是序號12的液相色譜 圖3是序號13的液相色譜 圖4是序號14的液相色譜 圖5是序號15的液相色譜 圖6是序號16的液相色譜 圖7是序號17的液相色譜 圖8是序號18的液相色譜 圖9是序號27的液相色譜 圖10是序號28的液相色譜 圖11是序號29的液相色譜 圖12是序號30的液相色譜 圖13是序號31的液相色譜 圖14是序號32的液相色譜 圖15是序號33的液相色譜 圖16是序號34的液相色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明，本發(fā)明所列舉實施例僅用于說明本發(fā)明，而并非是要局限本發(fā)明專利的保護范圍。實施例1精氨酸含量檢測的色譜條件初篩。乙腈與水或磷酸鹽比例見表I，檢測波長199nm ;流速lml/min ;柱溫30°C ;進樣量5μ1。表I初篩條件及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種精氨酸含量的測定方法，其特征在于，它應(yīng)用氰基柱采用高效液相色譜法對精氨酸進行含量測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述含量的測定方法，其特征在于，采用的高效液相色譜法所用的流動相為乙腈和磷酸鹽溶液，所述磷酸鹽溶液與乙腈的體積比為10 90 60 :40，優(yōu)選20 80 40 60o
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述含量的測定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液與乙腈的比例為 25 75 35 65ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述含量的測定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液，其中磷酸鹽選自磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種，濃度為5-100mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含量的測定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液中加入體積比為O. 1%-5%的三乙胺、氨水、二乙胺、乙二胺中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述含量的測定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液，其中磷酸鹽為三乙胺、氨水、二乙胺、乙二胺中的一種或幾種中加入磷酸后所成的鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含量的測定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液的pH為2.O 7. 0，優(yōu)選 3. O 4. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含量的測定方法，其特征在于，檢測波長為199nm，柱溫為.25 45°C，流速為 O. 5 2. Oml/min。
全文摘要
一種精氨酸含量的測定方法，所述方法包括1、取精氨酸原料和對照品溶于水中，分別制成對照溶液和供試品溶液；2、應(yīng)用氰基柱采用高效液相色譜法檢測精氨酸含量，以乙腈和磷酸鹽的水溶液為流動相，檢測波長為199nm，分別取等體積的對照溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，采用外標法計算精氨酸原料含量。本發(fā)明避免了精氨酸滴定方法的不專屬，避免了衍生化的繁瑣，為精氨酸檢測提供了快速、準確、重復(fù)性好的方法。
文檔編號G01N30/36GK103048396SQ20121031799
公開日2013年4月17日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者劉福利, 田建宣, 李慧英, 岳麗娜, 趙曉雷, 孟建, 張偉鋒, 田學(xué)文, 李巍 申請人:石家莊中碩藥業(yè)集團有限公司