腎炎清片中土大黃主要成分含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腎炎清片中土大黃主要成分含量的檢測方法，采用反相色譜法測定腎炎清片中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，色譜條件采用C18柱，流動(dòng)相為甲醇—0.1%磷酸溶液，檢測波長210-320nm。該方法操作簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可為腎炎清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。
【專利說明】腎炎清片中土大黃主要成分含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中成藥有效成分的檢測，特別涉及腎炎清片中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腎炎清片是由益母草、黃芪、白茅根、篇蓄、瞿麥、小薊、石韋、地榆炭、土大黃、甘草等制成的中藥復(fù)方制劑。方中君藥土大黃為酸模屬植物巴天酸模Rumex patientia L.的干燥根，從巴天酸模中發(fā)現(xiàn)的化合物主要包括蒽醌、萘及萘醌、黃酮、二苯乙烯苷和苯并呋喃酮等(朱晶晶，王崢濤，張朝鳳等.酸模屬植物中化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2008,39(3):450-454.)，蒽醌類成分作為其主要活性成分目前分離得到的主要有大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及其苷等(劉景，夏忠庭，周桂榮等.巴天酸模根化學(xué)成分研究[J].中草藥，2011,34(6):893-895 ;高黎明1，魏小梅，鄭尚珍等.巴天酸模中化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2002，33 (3):207-209.)。
[0003]目前，該藥材未被《中國藥典》收載，僅在天津、北京等地方標(biāo)準(zhǔn)中有載，但這些地方標(biāo)準(zhǔn)大多為上世紀(jì)九十年代制定，檢測手段落后，其檢測方法只停留在簡單的定性鑒別上，未收載可靠的含量測定方法，難以有效的控制藥材質(zhì)量。尤其在各級藥品標(biāo)準(zhǔn)以及各文獻(xiàn)檢索中，對含土大黃制劑的含測控制方法未見研究，這樣不能保證含土大黃復(fù)方制劑的安全、有效。為此，結(jié)合土大黃藥材的含量測定標(biāo)準(zhǔn)建立含土大黃復(fù)方制劑的含測標(biāo)準(zhǔn)，對復(fù)方制劑的質(zhì)量控制意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測腎炎清片中土大黃主要有效成分含量的方法，為腎炎清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。
[0005]本發(fā)明提供的腎炎清片中土大黃主要有效成分(大黃素、大黃酚和大黃素甲醚)含量的檢測方法，包括以下步驟:
[0006]1)以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為對照品，制成一定含量的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的溶液，通過高效液相色譜法測定其圖譜，由大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的特征吸收峰峰面積和對照品進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0007]2)將待測腎炎清片研細(xì)，加溶劑超聲處理，然后過濾取濾液，制得供試品；
[0008]3)在與步驟1)相同的色譜條件下測定步驟2)制得的供試品的高效液相色譜圖譜，并分別計(jì)算大黃素、大黃酚和大黃素甲醚相應(yīng)特征吸收峰的峰面積，根據(jù)步驟1)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測腎炎清片中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量。
[0009]上述步驟1)優(yōu)選用80-100%甲醇溶解大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品，制成大黃素濃度為6-25 μ g/ml、大黃酹濃度為6_25 μ g/ml和大黃素甲醚濃度為4_16 μ g/ml的對照品溶液，然后上樣進(jìn)行高效液相色譜。當(dāng)大黃素進(jìn)樣量在20.52-1026ng范圍內(nèi)特征吸收峰峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；當(dāng)大黃酚進(jìn)樣量在17.12-856ng范圍內(nèi)特征吸收峰峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；當(dāng)大黃素甲醚進(jìn)樣量在11.68-584ng范圍內(nèi)特征吸收峰峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。
[0010]上述步驟2)腎炎清片研細(xì)后加入6-15%鹽酸溶液中，超聲使之溶散，再加入三氯甲烷，加熱回流0.5-2小時(shí)，冷卻，分液，取有機(jī)相，去除溶劑，殘?jiān)?0-100%甲醇溶解，過濾取濾液。優(yōu)選的，180mg研細(xì)的腎炎清片粉末加入10mL 8%鹽酸溶液中，超聲使之溶散，再加三氯甲烷15mL，加熱回流1小時(shí)，冷卻后分液，取三氯甲烷層(即有機(jī)相)，水相(即酸液)用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑或水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，微孔濾膜(優(yōu)選0.45 μ m)濾過，即得。
[0011]上述步驟1)和3)中，所述高效液相色譜法是反相色譜法，其色譜條件是:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；流動(dòng)相是甲醇-(0.02、.2% )磷酸溶液，體積比為(0.5?19):1 ;檢測波長為210-320nm。在此條件下，色譜峰可以得到較好的分離，理論板數(shù)按大黃素計(jì)算應(yīng)不低于3000。
[0012]上述十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱優(yōu)選為Agilent 38_(:18柱，柱體積為 4.6X250mm，粒度為 5μπι;流速:0.8-1.5mL/min ;柱溫:25_40°C;流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(體積比85: 15);檢測波長為254nm。
[0013]本發(fā)明采用反相色譜法對腎炎清片中的土大黃主要有效成分大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量進(jìn)行測定，所提供的色譜條件可以使得色譜峰得到較好的分離，操作簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好。并且，通過這些有效成分的含量了解腎炎清片在生產(chǎn)過程中是否達(dá)到生產(chǎn)要求，為腎炎清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是實(shí)驗(yàn)例1得到的大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0015]圖2是實(shí)驗(yàn)例1得到的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0016]圖3是實(shí)驗(yàn)例1得到的大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017]腎炎清片中大黃主要成分含量測定的方法學(xué)研究
[0018]腎炎清片為中藥復(fù)方制劑，為了有效地控制本品的質(zhì)量，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以君藥土大黃中蒽醌類成分水解后的蒽醌苷元大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的總量為含測指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定本品含量。
[0019]1、儀器與試驗(yàn)用藥
[0020]儀器高效液相色譜儀:Waters 2695進(jìn)樣系統(tǒng)，Waters 2424ELSD檢測器；WatersEmpower色譜工作站；Mettler AE240 (十萬分之一)天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)。
[0021]試驗(yàn)用藥大黃素購自中國藥品生物檢定所(批號110756-200110)；
[0022]大黃酚購自中國藥品生物檢定所(批號110796-200615)；
[0023]大黃素甲醚購自中國藥品生物檢定所(批號110758-200912)；
[0024]甲醇為色譜純；水為二純水；檢驗(yàn)樣品及陰性樣品(由天士力制藥集團(tuán)股份有限公司提供)。[0025]2、色譜條件的選擇
[0026]色譜柱:AgilentZORBAX SB_C18 (5 μ m，250X4.6mm);流動(dòng)相:甲醇 _0.1% 磷酸溶液水(體積比85:15);柱溫:30°C;流速lml/min ;檢測波長為254nm。在此色譜條件下，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與樣品中其它組分分離良好，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算大于3000。
[0027]3、供試品溶液的制備
[0028]取重量差異項(xiàng)下腎炎清片內(nèi)容物，研細(xì)或粉碎，混勻，精密稱定180mg，置具塞錐形瓶中，加入8%鹽酸溶液10ml，超聲使溶散，再加三氯甲烷15ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌具塞錐形瓶，并入分液漏斗中，分液取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，即得。
[0029]4、空白試驗(yàn)
[0030]取缺土大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法操作，依法進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在對照品相同保留時(shí)間(6.5min、8.5min、10.7min)處無吸收峰。表明樣品中無干擾大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的成分存在。
[0031]5、線性關(guān)系的考察
[0032]精密稱取大黃素對照品5.13mg、大黃酚對照品4.28mg、大黃素甲醚對照品
2.92mg,置50ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品母液，精密吸取上述混合對照品母液1ml置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液；精密吸取上述混合對照品溶液各1μ 1、2μ 1、5μ 1、10μ 1、15μ 1、20μ 1、30μ 1、40μ 1、50 μ 1，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積，以對照品進(jìn)樣量x(ng)為橫坐標(biāo)，以峰面積值Y(mv.s)為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下。
[0033]表1.大黃素線性范圍測定結(jié)果
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種腎炎清片中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的檢測方法，包括以下步驟:1)以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為對照品，制成一定含量的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的溶液，通過高效液相色譜法測定其圖譜，由大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的特征吸收峰峰面積和對照品進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)將待測腎炎清片研細(xì)，加溶劑超聲處理，然后過濾取濾液，制得供試品；3)在與步驟1)相同的色譜條件下測定步驟2)制得的供試品的高效液相色譜圖譜，并分別計(jì)算大黃素、大黃酚和大黃素甲醚相應(yīng)特征吸收峰的峰面積，根據(jù)步驟1)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測腎炎清片中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)用80-100%甲醇溶解大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品，制成大黃素濃度為6-25μ g/ml、大黃酚濃度為6-25μ g/ml和大黃素甲醚濃度為4-16μ g/ml的對照品溶液，然后上樣進(jìn)行高效液相色譜。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)將腎炎清片研細(xì)后加入6-15%鹽酸溶液中，超聲使之溶散，再加入三氯甲烷，加熱回流0.5-2小時(shí)，冷卻，分液，取有機(jī)相，去除溶劑，殘?jiān)?0-100%甲醇溶解，過濾取濾液，制得供試品。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)取180mg研細(xì)的腎炎清片粉末加入10mL 8%鹽酸溶液中，超聲使之溶散，再加三氯甲烷15mL，加熱回流1小時(shí)，冷卻后分液，取三氯甲烷層，水相用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑或水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，微孔濾膜濾過，即得供試品。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)和3)中采用的高效液相色譜法是反相色譜法。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)和3)進(jìn)行高效液相色譜的色譜條件是:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；流動(dòng)相是甲醇-(0.02、.2% )磷酸溶液，體積比為(0.5?19):1 ;檢測波長為210-320nm。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱是Agilent 313-(318柱，柱體積為4.6X 250mm,粒度為5 μ m ;流速:0.8-1.5mL/min ；柱溫:25-40°C。
【文檔編號】G01N30/02GK103675111SQ201210327760
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月6日
【發(fā)明者】周桂榮, 鄂秀輝, 劉艷, 張?zhí)m蘭, 周水平 申請人:天士力制藥集團(tuán)股份有限公司