專利名稱：促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種修飾電極及其制備方法，還涉及以該修飾電極作為工作電極組建的電化學(xué)生物傳感器及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是一種糖蛋白激素,在人體內(nèi)主要是由腎臟生成的一種造血生長(zhǎng)因子，其生理功能是促進(jìn)骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放。1985年人類首次利用基因工程技術(shù)合成了重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythopoietin,rhEPO)，由于其具有分裂原和分化原的雙重功能，能在不輸血的情況下產(chǎn)生輸血效應(yīng)，使病人避免病毒感染和輸血過(guò)量的危險(xiǎn)，已在腎性貧血的治療方面發(fā)揮出重要作用。同時(shí)，因其具有提高機(jī)體攜氧能力、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力的特性，rhEPO在體育運(yùn)動(dòng)中成為新的興奮劑。2005 年起，國(guó)際奧委會(huì)和世界反興奮劑機(jī)構(gòu)的禁用清單中，rhEPO被列為體育競(jìng)技中禁用的首個(gè)肽類物質(zhì)。由于EPO與rhEPO具有完全相同的生物活性和基本一致的分子結(jié)構(gòu)，唯一差別僅在于等電點(diǎn)不同，EPO的等電點(diǎn)為3. 7 4. 7，rhEPO的等電點(diǎn)為4. 4 5· 1，因此精確區(qū)分EPO與rhEPO具有諸多困難。長(zhǎng)期以來(lái)，EPO與rhEPO的甄別檢測(cè)大多采用質(zhì)譜、等電聚焦、凝膠電泳等方法相結(jié)合，但這些檢測(cè)方法存在實(shí)驗(yàn)分離時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)效率低、特異性差等缺點(diǎn)，不能滿足對(duì)EPO和rhEPO進(jìn)行快速、精確甄別的要求。因此，研究一種特異性好、靈敏度高、能夠快速、精確甄別EPO和rhEPO的檢測(cè)方法及工具勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種修飾電極，目的之二在于提供一種所述修飾電極的制備方法，目的之三在于提供一種以該修飾電極作為工作電極組建的電化學(xué)生物傳感器，目的之四在于提供一種利用所述電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)EPO和/或rhEPO的方法，所述修飾電極制備簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定，以其為工作電極組建的電化學(xué)生物傳感器可以快速、特異、靈敏地檢測(cè)EPO和/或rhEPO，特別是能對(duì)EPO和rhEPO進(jìn)行快速、精確甄別。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
I.促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)修飾電極,所述修飾電極是在電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定有EPOR作為識(shí)別元件的玻碳電極。2. EPOR修飾電極的制備方法，包括以下步驟
a.玻碳電極的預(yù)處理將玻碳電極表面拋光，清潔，干燥，備用；
b.ZnO溶膠-凝膠的制備將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰，制得ZnO溶膠-凝膠溶液，備用；
c.EPOR的固定將EPOR溶液與步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液混勻，滴加至經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，干燥成膜，洗滌，即制得EPOR修飾電極。優(yōu)選的，所述步驟a是將玻碳電極依次用0. 3 μ m和0.05 μ m的三氧化二鋁粉末拋光打磨，每次打磨后先用水洗凈，再依次用硝酸、丙酮和水超聲洗滌，空氣中晾干。優(yōu)選的，所述步驟b是將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中制成濃度為O. lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為O. 067mol/L,制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水乙醇按體積比為2: f 1:3進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。更優(yōu)選的，所述步驟b是將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中制成濃度為O. lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為O. 067mol/L,制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水乙醇按體積比為1:2進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。優(yōu)選的，所述步驟c是將步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為IOng/L^lOO μ g/L的EPOR溶液按照體積比為4: f I: I. 15混合均勻，再將混合液滴加在經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，即制得EPOR修飾電極。
更優(yōu)選的，所述步驟c是將步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為I μ g/L的EPOR溶液按照體積比為I: I混合均勻，再將混合液滴加在經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，即制得EPOR修飾電極。3. EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器，包括工作電極、對(duì)電極、參比電極和測(cè)試底液，所述工作電極為前述EPOR修飾電極，對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘汞電極；所述測(cè)試底液為含有 2mmol/L K3[Fe (CN)6]和 2mmol/L K4[Fe (CN)6](后續(xù)簡(jiǎn)寫為 2mmol/LK3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6])且 pH 為 6. 2 9. O 的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述測(cè)試底液為含有2mmol/L K3 [Fe (CN) J-K4 [Fe (CN)6]且pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液。4.利用前述EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)EPO和/或rhEPO的方法，是將EPOR修飾電極與樣品溶液共孵育20分鐘以上，然后以EPOR修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]且pH為6. 2^9. O的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0. 3疒0. 7V，電位掃描速率為l(Tl00mv/s，根據(jù)電位0. Γθ. 17V處的峰電流和EPO標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中EPO的濃度，和/或根據(jù)電位0. 06 0. 09V處的峰電流和rhEPO標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中rhEPO的濃度。優(yōu)選的，所述EPOR修飾電極與樣品溶液的共孵育時(shí)間為20分鐘，所述電位掃描速率為 50mv/s。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的EPOR修飾電極制備方法簡(jiǎn)單，性能穩(wěn)定，4°C避光放置50天后的響應(yīng)電流值仍然維持在初始值的77%左右，以其為工作電極構(gòu)建的三電極體系電化學(xué)生物傳感器可以快速、特異、靈敏地檢測(cè)EPO和/或rhEPO，線性范圍均為5pg/L 500ng/L，檢出限均低至0. 5pg/L，特別是能根據(jù)峰電位對(duì)EPO和rhEPO進(jìn)行快速、精確甄另O，不但適用于低濃度EPO或rhEPO的檢測(cè)，而且適用于體育競(jìng)技中對(duì)興奮劑rhEPO的檢測(cè)。


圖I為ZnO溶膠-凝膠貯備液和無(wú)水乙醇的稀釋比對(duì)EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖2為ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比對(duì)EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖3為EPOR溶液濃度對(duì)EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖4為測(cè)試底液的pH值對(duì)EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖5為工作電極在樣品溶液中的孵育時(shí)間對(duì)EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖6為循環(huán)伏安法掃描電位對(duì)EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖7為以EPOR修飾電極為工作電極構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng)及傳感器特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中a為單純ZnO溶膠-凝膠修飾電極在PBS溶液中的循環(huán)伏安曲 線；b為裸玻碳電極在含有2mmol/L K3 [Fe (CN) J-K4[Fe (CN)6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線；c為單純ZnO溶膠-凝膠修飾電極在含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線；d SEPOR修飾電極在含有2mmol/L K3[Fe (CN) J-K4[Fe (CN)6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線；e為EPOR修飾電極在干擾物質(zhì)溶液(500ng/L IgA、500ng/L IgG和500ng/L IgM)中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線；f為EPOR修飾電極在500ng/L EPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線；g為EPOR修飾電極在500ng/L rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線。圖8為EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器在最佳條件下檢測(cè)獲得的EPO標(biāo)準(zhǔn)曲線和rhEPO標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9為EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器在貯存不同時(shí)間后的電流響應(yīng)值變化。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中所用的主要試劑和儀器來(lái)源如下一水氫氧化鋰LiOH · H20、二水乙酸鋅Zn (Ac) 2 · 2H20購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，K3 [Fe (CN) 6]、K4 [Fe (CN) 6]購(gòu)自重慶東方試劑廠，玻碳電極、飽和甘汞電極、鉬電極、0. 3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉末購(gòu)自天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司，PBS粉末購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EPOR購(gòu)自美國(guó)NovusBiologicals公司，EPO和rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Abnova公司。KQ-5200B型超聲波清洗器為江蘇省昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品，CHI660C型電化學(xué)工作站為上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品，ZD-2自動(dòng)電位滴定儀為上海精科雷磁有限公司產(chǎn)品。一、EPOR修飾電極的制備及參數(shù)優(yōu)化 EPOR修飾電極的制備方法具體包括以下步驟
a.玻碳電極的預(yù)處理取直徑為3mm的玻碳電極,依次用0.3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉末進(jìn)行拋光打磨，每次打磨后先用超純水洗凈，再依次于硝酸、丙酮和超純水中超聲洗滌5分鐘，空氣中晾干；
b.ZnO溶膠-凝膠溶液的制備將Zn(Ac)2 · 2H20 2. 20g (O. Olmol)溶于100ml無(wú)水乙醇中，再在超聲波作用下緩慢加入LiOH · H2O 0. 28g (6. 7mmol),制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，4°C保存?zhèn)溆?，臨用前按照體積比為1:2加入無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液；
c.EPOR的固定將濃度為I μ g/L的EPOR溶液與步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液按照體積比1:1混勻，取混合液10 μ I滴在經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，室溫干燥16小時(shí)使電極表面的膠體形成凝膠，最后用PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)充分洗滌，即制得EPOR修飾電極，不用時(shí)置4°C避光保存。本發(fā)明在研究過(guò)程中對(duì)影響EPOR修飾電極電流響應(yīng)的主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。將以不同參數(shù)制備的EPOR修飾電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬電極作為對(duì)電極組建電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/L K3[Fe (CN) J-K4[Fe (CN)6]的PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)作為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-O. 3V、. 7V，電位掃描速率為50mv/s。結(jié)果顯示，ZnO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的稀釋比、ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比、EPOR溶液的濃度都會(huì)影響EPOR修飾電極的電流響應(yīng)，ZnO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的稀釋比優(yōu)選為2:廣1:3，更優(yōu)選為1:2(圖I )，ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比優(yōu)選為4:1 1:1. 15，更優(yōu)選為1:1(圖2)，EPOR溶液的濃度優(yōu)選為10叩/1 1001^/1，更優(yōu)選為I μ g/L (圖3)。二、EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及參數(shù)優(yōu)化
將EPOR修飾電極與樣品溶液孵育20分鐘，然后以EPOR修飾電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉬電極為對(duì)電極構(gòu)建EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/LK3[Fe (CN) J-K4 [Fe (CN)6]的PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-O. 3V、. 7V，電位掃描速率為50mv/s。本發(fā)明在研究過(guò)程中對(duì)影響EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的主要參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，測(cè)試底液的PH值為6. 2^9. O時(shí)傳感器的峰電流較大，pH值為7. 4時(shí)傳感器的峰電流最大，因此，測(cè)試底液的pH值優(yōu)選為6. 2^9. 0，更優(yōu)選為7. 4 (圖4);EPOR修飾電極與500ng/L EPO或rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孵育時(shí)間從5分鐘增加至20分鐘，傳感器的峰電流逐漸降低并達(dá)到最小值，之后繼續(xù)增加孵育時(shí)間至40分鐘，峰電流基本保持不變，說(shuō)明20分鐘時(shí)EPOR修飾電極上結(jié)合的EPO或rhEPO已達(dá)到飽和，因此EPOR修飾電極與樣品溶液的孵育時(shí)間優(yōu)選為20分鐘以上，更優(yōu)選為20分鐘(圖5)。此外，掃描電位的變化對(duì)K3[Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]氧化還原峰的峰電位的影響不大，但對(duì)傳感器的電流響應(yīng)的影響較為明顯，在-0. 3V、. 7V之間有最好的電流響應(yīng)(圖6)。電位掃描速率影響循環(huán)伏安曲線的形狀，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，電位掃描速率在1(T100 mv/s范圍內(nèi)都可行，當(dāng)其為50mv/s時(shí)循環(huán)伏安曲線最光滑。三、EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)性能 I、特異性
將EPOR修飾電極與樣品溶液孵育20分鐘，然后將EPOR修飾電極與鉬電極、飽和參比電極組成電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0. 3V 0. 7V，電位掃描速率為50mv/s。傳感器的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，曲線a為單純ZnO溶膠-凝膠修飾電極在PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，只能觀測(cè)到背景電流；曲線b為裸玻碳電極在含有2mmol/LK3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，由于在PBS溶液中加入了氧化還原探針K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]，循環(huán)伏安曲線有明顯改變，出現(xiàn)了一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；曲線c為單純ZnO溶膠-凝膠修飾電極在含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，由于ZnO溶膠-凝膠薄膜在一定程度上阻礙了溶液中導(dǎo)電離子在電極上的電子傳遞，氧化還原峰的峰電流降低；曲線d為EPOR修飾電極在含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，與曲線c有明顯不同，說(shuō)明EPOR已成功修飾到電極表面，由于EPOR是生物大分子，被吸附在電極表面后阻礙電子傳輸，氧化還原峰的峰電流較曲線c進(jìn)一步降低；曲線e為EPOR修飾電極在干擾物質(zhì)溶液(500ng/L IgA、500ng/L IgG和500ng/L IgM)中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線，與曲線d相比，基本保持不變，說(shuō)明IgA、IgG、IgM等干擾物質(zhì)不會(huì)影響EPO和rhEPO的檢測(cè)；曲線f為EPOR修飾電極在500ng/L EPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線，孵育前后響應(yīng)電流變化值(Λ I)為8. 2 μ A，峰電流出現(xiàn)在電位O. 16V處，由于溶液中的EPO與電極上的EPOR特異性結(jié)合形成的EPO-EPOR復(fù)合物覆蓋了更多的電極表面，進(jìn)一步阻礙了電子傳輸，因此氧化還原峰的峰電流較曲線d明顯降低；曲線g為EPOR修飾電極在500ng/L rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孵育20分鐘后的循環(huán)伏安曲線,孵育前后響應(yīng)電流變化值(Δ I)為9. 7μ A,同樣由于rhEPO與EPOR特異性結(jié)合形成的rhEP0_EP0R復(fù)合物阻礙了電子傳輸，氧化還原峰的 峰電流較曲線d明顯降低，但由于rhEPO與EPO的等電點(diǎn)不同，導(dǎo)致rhEP0_EP0R復(fù)合物與EPO-EPOR復(fù)合物的工作電位不同，與曲線f相比，曲線g的氧化還原峰向負(fù)電位方向移動(dòng)，峰電流出現(xiàn)在電位O. 08V處，從而通過(guò)氧化還原峰的峰電位可以將EPO和rhEPO精確區(qū)分開來(lái)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的EPOR修飾電極抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)EPO和rhEPO具有良好的選擇性，并能對(duì)EPO和rhEPO進(jìn)行精確甄別檢測(cè)。、線性范圍和檢出限
將EPOR修飾電極分別與不同濃度的EPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液、rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液孵育20分鐘，然后與鉬電極、飽和參比電極構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/LK3[Fe (CN) J-K4 [Fe (CN)6]的PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，考察峰電流與EP0、rhEP0濃度的關(guān)系，電位掃描范圍為-0. 3V、. 7V，電位掃描速率為50mv/s。結(jié)果見圖8，當(dāng)EPO的濃度為5pg/L 500ng/L時(shí)，EPO濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=2. 1674x+17. 691，相關(guān)系數(shù)為0. 9966，檢出限為0. 5pg/L ;當(dāng)rhEPO的濃度為5pg/L 500ng/L時(shí)，rhEPO濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=l. 5737x+14. 765，相關(guān)系數(shù)為0. 9935，檢出限為0. 5pg/L。以上結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。、穩(wěn)定性
將新制備的EPOR修飾電極分別于4 °C避光放置10、20、30、40、50、60天，然后與鉬電極、飽和參比電極構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/L K3 [Fe (CN) 6] -K4 [Fe (CN) 6]的PBS溶液(pH7. 4,0. 05mol/L)為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，考察EPOR修飾電極的穩(wěn)定性，電位掃描范圍為-0. 3疒0. 7V，電位掃描速率為50mv/s。結(jié)果見圖9，EP0R修飾電極在放置20天后，響應(yīng)電流值約為初始值的95% ;放置40天后，響應(yīng)電流值下降至初始值的82% ;放置50天后，響應(yīng)電流值仍然維持在初始值的77%左右，說(shuō)明本發(fā)明的EPOR修飾電極具有良好的穩(wěn)定性，使用壽命較長(zhǎng)。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極，其特征在干，所述修飾電極是在電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定有促紅細(xì)胞生成素受體作為識(shí)別元件的玻碳電扱。
2.權(quán)利要求I所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a.玻碳電極的預(yù)處理將玻碳電極表面拋光，清潔，干燥，備用； b.ZnO溶膠-凝膠的制備將こ酸鋅溶于無(wú)水こ醇中，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰，制得ZnO溶膠-凝膠溶液，備用； c.促紅細(xì)胞生成素受體的固定將步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液與促紅細(xì)胞生成素受體溶液混勻，滴加至經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，干燥成膜，洗滌，即制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在于，所 述步驟a是將玻碳電極依次用0. 3 m和0. 05 m的三氧化ニ鋁粉末拋光打磨，毎次打磨后先用水洗浄，再依次用硝酸、丙酮和水超聲洗滌，空氣中晾干。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在于，所述步驟b是將こ酸鋅溶于無(wú)水こ醇中制成濃度為0. lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為0. 067mol/L，制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水こ醇按體積比為2: f 1:3進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在于，所述步驟b是將こ酸鋅溶于無(wú)水こ醇中制成濃度為0. lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為0. 067mol/L，制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水こ醇按體積比為1:2進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在于，所述步驟c是將步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為10ng/L 100 u g/L的促紅細(xì)胞生成素受體溶液按照體積比為4: f I: I. 15混合均勻，再將混合液滴加在經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，即制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電扱。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，其特征在干，所述步驟c是將步驟b制得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為I y g/L的促紅細(xì)胞生成素受體溶液按照體積比為I: I混合均勻，再將混合液滴加在經(jīng)步驟a預(yù)處理的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，即制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電扱。
8.促紅細(xì)胞生成素和重組人促紅細(xì)胞生成素電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，包括エ作電極、對(duì)電極、參比電極和測(cè)試底液；所述工作電極為權(quán)利要求I所述的促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極，對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘汞電極；所述測(cè)試底液為含有2mmol/LK3[Fe (CN)6]和 2mmol/L K4 [Fe (CN)6]且 pH 為 6. 2 9. 0 的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的促紅細(xì)胞生成素和重組人促紅細(xì)胞生成素電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述測(cè)試底液為含有2mmol/L K3[Fe (CN)6]和2mmol/L K4[Fe (CN)6]且pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。
10.利用權(quán)利要求8所述電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，將促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極與樣品溶液共孵育20分鐘以上，然后以促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有 2mmol/L K3 [Fe (CN)6]和 2mmol/L K4 [Fe (CN)6]且 pH 為 6. 2 9. O 的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍 為-O. 3V、. 7V，電位掃描速率為KTlOOmv/s，根據(jù)電位O. Γθ. 17V處的峰電流和促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中促紅細(xì)胞生成素的濃度，和/或根據(jù)電位O. 06、. 09V處的峰電流和重組人促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中重組人促紅細(xì)胞生成素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極，是在電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定有促紅細(xì)胞生成素受體作為識(shí)別元件的玻碳電極，該修飾電極制備方法簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定，4℃避光放置50天后響應(yīng)電流值仍維持在初始值的77%左右；以該修飾電極為工作電極、鉑電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液組建電化學(xué)生物傳感器，可以快速、特異、靈敏地檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和/或重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，線性范圍為5pg/L~500ng/L，檢出限低至0.5pg/L，特別是能根據(jù)峰電位對(duì)EPO和rhEPO進(jìn)行精確甄別，不但適用于低濃度EPO或rhEPO的檢測(cè)，而且適用于體育競(jìng)技中對(duì)興奮劑rhEPO的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102854231SQ201210328850
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者王云霞, 張立群, 府偉靈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院