專利名稱：一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，糖尿病控制不好會引發(fā)多種并發(fā)癥，可以使人體多組織多器官受損，致殘、致死率高。糖尿病已經(jīng)成為全球性流行病，根據(jù)WHO的報告，全世界的糖尿病患者大約有I. 6億，糖尿病在我國總?cè)藬?shù)已達(dá)4000萬以上，僅次于印度，居
世界第二，危害巨大。目前，對糖尿病的治療的主要干預(yù)策略是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量等。I型糖尿病由于胰腺產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞已經(jīng)徹底損壞，只能依靠是依賴胰島素治療。
II型糖尿病約占糖尿病人數(shù)的90%，目前臨床治療II型糖尿病的藥物主要包括雙胍類藥物、噻唑烷二酮類胰島素增敏劑類藥物、糖苷酶抑制劑類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類藥物等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)很多中成藥及天然產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的降糖活性，尤其是通過多靶點(diǎn)、多途徑作用來控制血糖含量。從中藥及天然產(chǎn)物中篩選發(fā)現(xiàn)具有多方面降糖活性的化合物成為研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的篩選方法包括提取、分離、純化出單體化合物，然后進(jìn)行活性篩選。如公開號為101437529的中國專利文獻(xiàn)報道了一種具有抗病毒活性的類黃酮化合物，該化合物是在魚腥草的提取物中分離得到，先用甲醇提取魚腥草的提取物，將提取物減壓濃縮并且將其用乙酸乙酯提取得到乙酸乙酯提取物；再將濃縮物于甲醇中溶解，并通過色譜法分離/純化得到的類黃酮化合物，再對其物理化學(xué)性質(zhì)以及抗病毒活性進(jìn)行研究分析。這種方法耗時耗力效率低，而且化合物在分離純化過程中可能降解變性失去活性，或者分離出非目標(biāo)化合物。目前，基于親和選擇-質(zhì)譜的方法在藥用植物活性成分篩選中的應(yīng)用越來越多，該法通過發(fā)現(xiàn)混合物中的靶點(diǎn)結(jié)合物，然后進(jìn)行鑒定，可以大大加速篩選的過程。如公開號為101339167的中國專利文獻(xiàn)報道了一種基于靶蛋白親和選擇的活性成分或活性成分群的高通量篩選方法，通過將靶蛋白與待測化合物在緩沖液中孵育，孵育得到的混合溶液上樣于分子排阻色譜柱或在線固相提取柱，緩沖液洗脫，洗脫液經(jīng)解離，解離液再經(jīng)在線固相提取柱分離，最后導(dǎo)入高效液相-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)確證，并對其進(jìn)行定量分析，計算這些活性成分對于靶蛋白的結(jié)合率，以評價其活性。基于親和選擇-質(zhì)譜的方法包括親和超濾法、磁珠法、渦流色譜法、親和細(xì)胞膜色譜法等。然而，現(xiàn)有篩選方法只能對單一靶點(diǎn)或酶進(jìn)行篩選，目前仍缺乏針對多個靶點(diǎn)或酶的快速篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中只能針對單一祀點(diǎn)或酶的活性化合物進(jìn)行篩選的問題。
一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法，包括制備鍵合酶磁珠；利用至少兩種鍵合酶磁珠對中藥溶液或天然提取物溶液進(jìn)行選擇性吸附，不同種鍵合酶磁珠上所鍵合的靶標(biāo)蛋白互異，所述的靶標(biāo)蛋白為麥芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶；分離出所有鍵合酶磁珠共同吸附的化合物作為樣本集；通過針對靶標(biāo)蛋白的抑制活性實驗在樣本集中篩選所述的抗糖尿病活性化合物。本發(fā)明在磁珠上鍵合的酶為麥芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶，也可以鍵合其它糖苷鏈水解酶，如淀粉酶，異構(gòu)麥芽糖酶，乳糖酶等。糖苷鏈水解酶可以分解糖類釋放葡萄糖，葡萄糖被小腸上皮吸收后進(jìn)入血液，成為血糖。磁珠由于可吸附具有糖苷鏈水解酶抑制活性的化合物，這些糖苷鏈水解酶抑制劑通過可逆性抑制或競爭性抑制糖苷酶，延遲多糖、雙糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，減緩餐后血糖的升高，此外還可以刺激胰島素的分泌，降低血糖濃度，在治療 糖尿病、減肥等藥物開發(fā)方面具有光明的前景。將不同的靶標(biāo)蛋白即受體(如麥芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶等)所鍵合的磁珠，分別被放入循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)的不同反應(yīng)區(qū)內(nèi)，中藥溶液或天然提取物溶液被置于循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，與鍵合酶磁珠在一定溫度下孵育一段時間之后，通過流動清洗將未結(jié)合的化合物和靶標(biāo)蛋白-配體復(fù)合物進(jìn)行分離，加有機(jī)試劑使配體從靶標(biāo)蛋白-配體復(fù)合物中解離出來，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析，最后用傳統(tǒng)的活性測定方法對這些配體的活性進(jìn)行驗證。所述選擇性吸附時，將中藥溶液或天然提取物溶液置入一循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，該循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)具有多個反應(yīng)區(qū)，鍵合有不同靶標(biāo)蛋白的鍵合酶磁珠處于各自對應(yīng)的反應(yīng)區(qū)內(nèi)。這樣，可以通過動力裝置如蠕動泵將中藥溶液或天然提取物溶液泵入循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，并循環(huán)孵育，可以使多種鍵合酶磁珠同時完成吸附，制備鍵合酶磁珠是本發(fā)明實施過程中的關(guān)鍵，所述制備鍵合酶磁珠的過程為將磁珠清洗干凈，加入活化試劑活化磁珠表面，再次清洗，加入溶解的靶標(biāo)蛋白，孵育，移去上清液，經(jīng)緩沖液沖洗后再加入溶解了牛血清白蛋白的PBS溶液，移去上清液得到鍵合酶磁珠得到鍵合酶磁珠。為了避免雜質(zhì)的干擾，在制備鍵合酶磁珠之前要先將磁珠清洗干凈，所述磁珠的清洗試劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸的水溶液，濃度為10 50mmol/L，pH為4 8 ;更優(yōu)選為，濃度為25mmol/L，pH為6 ;清洗試劑的加入量沒有特殊要求，可根據(jù)磁珠的量進(jìn)行調(diào)整，清洗時間一般為IOmin左右，清洗兩次即可。清洗后的磁珠要活化后才能夠結(jié)合靶標(biāo)蛋白，將磁珠與活化試劑室溫孵育30min左右，移去上清液，用所述的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗；所述的活化試劑為I-乙基-3- (3- 二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液，溶液濃度分別為10 80mg/mL, 10 80mg/mL。I-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-輕基琥珀酰亞胺溶液的溶劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸的水溶液。鍵合時，先將靶標(biāo)蛋白溶解，所述靶標(biāo)蛋白由25mmol/L、pH為6的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸的水溶液溶解，靶標(biāo)蛋白的濃度為O. 5 2mg/mL。溶解后將其與活化好的磁珠震蕩混勻，孵育，所述孵育的時間為I 5h，溫度為O 25°C ;更優(yōu)選為，孵育的時間為2h，溫度為4°C。移去上清液，可用PBS緩沖液清洗掉鍵合酶磁珠上未結(jié)合的化合物，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. I O. 5%的牛血清白蛋白的PBS溶液覆蓋磁珠上未結(jié)合的活性位點(diǎn)，震蕩混勻，棄去上清液。對鍵合酶磁珠質(zhì)量的考察，可米用掃描式電子顯微鏡對鍵合酶磁珠的表面掃描成像，一般磁珠表面不粗糙、較光滑的表明磁珠鍵合情況良好。鍵合酶磁珠制備完成后，利用鍵合有不同靶標(biāo)蛋白的鍵合酶磁珠對中藥溶液或天然提取物溶液進(jìn)行選擇性吸附，達(dá)到初步篩選的目的，而后洗脫分離鍵合酶磁珠上吸附的化合物，進(jìn)行所述的活性化合物的篩選。所述中藥溶液或天然提取物溶液的溶劑為PBS緩沖液，所述PBS緩沖液的離子強(qiáng)度為I 300mmol/L, pH為5. O 8. O ;更優(yōu)選為，PBS緩沖液的離子強(qiáng)度為10mmol/L, pH為 6. 8。所述選擇性吸附時，將中藥溶液或天然提取物溶液置入一循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，該循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)具有多個反應(yīng)區(qū)，鍵合有不同靶標(biāo)蛋白的鍵合酶磁珠處于各自對應(yīng)的反應(yīng)區(qū)內(nèi)。這樣，可以通過動力裝置如蠕動泵將中藥溶液或天然提取物溶液泵入循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，并循環(huán)孵育，可以使多種鍵合酶磁珠同時完成吸附，蠕動泵保持轉(zhuǎn)速為20 60r/min，優(yōu)選 為 40r/mino反應(yīng)區(qū)內(nèi)設(shè)有磁鐵以固定鍵合酶磁珠，防止鍵合酶磁珠被流動的中藥溶液或天然提取物溶液沖走，而導(dǎo)致不同種鍵合酶磁珠相互混雜。在所述的選擇性吸附中，反應(yīng)區(qū)內(nèi)的鍵合酶磁珠浸沒在反應(yīng)通道內(nèi)的中藥溶液或天然提取物溶液中進(jìn)行孵育，所述孵育的時間為10 60min，溫度為20 50°C ;更優(yōu)選為，孵育的時間為45min，溫度為37°C。乙腈的水溶液可以將吸附在鍵合酶磁珠表面的化合物洗脫下來，其中乙腈的體積百分比濃度為10%，然后對洗脫液進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，以所有鍵合酶磁珠共同吸附的化合物作為樣本集。對于樣本集中各化合物的獲取，可以采用常規(guī)柱色譜分離技術(shù)分離獲取樣本集，再采用液相色譜分離、純化樣本集中各化合物或購置相對應(yīng)的化合物，通過對靶標(biāo)蛋白的抑制活性實驗在樣本集中篩選所述的抗糖尿病活性化合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明可以從中藥或天然產(chǎn)物提取物中針對多靶點(diǎn)或酶篩選抗糖尿病化合物，并應(yīng)用于抗糖尿病藥物的研制。(2)本發(fā)明對篩選抗糖尿病活性化合物的方法的條件進(jìn)行了優(yōu)化，快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。(3)本發(fā)明通過鍵合酶磁珠的選擇性吸附達(dá)到初篩的目的，減少了傳統(tǒng)方法中初篩時化合物制備分離的步驟，提高了篩選效率、縮短了篩選時間。


圖I為三葉糖脂清提取物溶液中磁珠洗脫液分析譜圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和實施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，該實施例僅用于說明本發(fā)明而非對本發(fā)明的限制。實施例所用儀器AgiLent 100型液相色譜(AgiLent公司);Finnigan LCQ DecaXPpLus液質(zhì)聯(lián)用儀器(Finnigan公司)。一、基于多種鍵合酶磁珠的活性化合物篩選系統(tǒng)I.試劑及溶液配制麥芽糖酶、鹿糖酶、豬胰腺脂肪酶(Simga公司)；羧基磁珠Dynabeads&reg MyOneCarboxyLic Acid,規(guī)格10mg/mL (invitrogen 公司);I-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，sigma公司);2_(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES，sigma公司);N_羥基琥珀酰亞胺(NHS, sigma 公司)。25mmol/L的MES的水溶液配制稱取MES適量，加水溶解，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至6，制成濃度為25mmol/L的MES溶液。50mg/mL EDC溶液配制稱取EDC適量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中， 制成濃度為50mg/mL的EDC溶液。臨用時新鮮配制。50mg/mL NHS溶液配制稱取NHS適量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成濃度為50mg/mL的NHS溶液。臨用時新鮮配制。lmg/mL麥芽糖酶、蔗糖酶及豬胰腺脂肪酶(以下稱脂肪酶)溶液配制分別稱取麥芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶lmg，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成濃度為Img/mL的麥芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶溶液。臨用時新鮮配制。2.鍵合酶磁珠的制備磁珠活化取300 μ L磁珠，加入等體積25mmol/L的MES (pH為6)是水溶液清洗兩次，每次lOmin，棄去清洗液，加入50 μ L新鮮配置50mg/mL EDC溶液和50 μ L的50mg/mLNHS溶液，混合均勻，在室溫下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育30min。孵育后，把管子放于磁鐵上4min，移除上清液，使用300 μ L 25mmol/L MES的水溶液清洗兩次。磁珠鍵合在活化磁珠中，分別加入lmg/mL麥芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶溶液60 μ L，再加入25mmol/L MES溶液40 μ L，震蕩混合均勻，4°C緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育2h，孵育后，把管子放于磁鐵上4min，移除上清液。加lOmmol/L PBS緩沖液300 μ L沖洗包被的磁珠4次。3.鍵合酶磁珠質(zhì)量考察將制備的鍵合酶磁珠分散在lOmmol/L PBS緩沖液中，使用掃描式電子顯微鏡對空白磁珠、麥芽糖酶鍵合酶磁珠、蔗糖酶鍵合酶磁珠及脂肪酶鍵合酶磁珠的表面分別進(jìn)行掃描成像，檢查磁珠鍵合情況。結(jié)果表明，空白磁珠表面非常粗糙，鍵合酶磁珠表面比較光滑，表明酶已鍵合于磁珠表面。4.基于多種鍵合酶磁珠的活性化合物篩選系統(tǒng)該系統(tǒng)由連接腔、蠕動泵、永久磁鐵、磁珠、化學(xué)信息獲取和處理軟件構(gòu)成，其中質(zhì)譜信息由Finnigan液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀獲取。二、基于多種鍵合酶磁珠的活性化合物篩選條件的優(yōu)化以咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷為模型藥物，對篩選條件進(jìn)行優(yōu)化。各取IOOyL麥芽糖酶鍵合的磁珠、蔗糖酶鍵合的磁珠、甘油三酯酶鍵合的磁珠分別放入三個連接腔中的連通容器(相當(dāng)于三個相互連通的反應(yīng)區(qū))中，配制咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液40mL(終濃度0. lmg/mL),用螺動泵將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液泵入連通容器中，循環(huán)孵育一定時間，用PBS緩沖液清洗3次，每次的清洗液依次進(jìn)液相分析，平行操作三份。將清洗液棄去，每個連通容器中加入乙腈的水溶液(其中含乙腈lmL，含水9mL)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行液相分析，平行操作三份。分別使用不同pH(5. 6，6. 2，6. 8，7. 4，8. O)和不同離子強(qiáng)度的(10，50，100，200，300mmol/L)PBS緩沖液溶解咖啡酸、阿魏酸或橙皮苷，將混合液為孵育溶液進(jìn)行孵育，進(jìn)行清洗，對清洗液進(jìn)行液相分析，平行操作三份。不同孵育時間(10，20，30，45，60min)和不同孵育溫度(20，25，30，37，40，45°C)下孵育后，進(jìn)行清洗，對洗脫液進(jìn)行液相分析，平行操作三份。調(diào)控蠕動泵的轉(zhuǎn)速(20，30，40，50，60r/min)，考察流速對配體結(jié)合的影響。分別配制一系列的咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液40mL(終濃度O. 01，
O.02，O. 04，O. 06，O. 08，O. lmg/mL)，用蠕動泵將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液泵入連通容器中，循環(huán)孵育一定時間，用PBS緩沖液清洗3次，每次的清洗液依次進(jìn)液相分析，平行操作三份。將清洗液棄去，每個連通容器中加入IOmL乙腈的水溶液(乙腈的體積百分?jǐn)?shù)為10% )溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行液相分析，平行操作三份。結(jié)合率=[DB]/[D]Tra，其中[D]TOT為加入標(biāo)準(zhǔn)品 的濃度，[DB]為10%乙腈的水溶液洗脫后的洗脫液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。清洗次數(shù)的考察結(jié)果表明，經(jīng)過三次的清洗，非特異性結(jié)合的化合物已經(jīng)被清洗干凈。研究發(fā)現(xiàn)，麥芽糖酶鍵合的磁珠在不同濃度的PBS緩沖液(pH值7. 4)下的zeta電位分別為 _17. 45mV (10mmol/L)、-13. 83mV (IOOmmol/L)、-13. 69mV (300mmol/L)。過高離子濃度的PBS緩沖液中和了麥芽糖酶或蔗糖酶鍵合的磁珠表面的電荷，導(dǎo)致咖啡酸和阿魏酸的結(jié)合效率顯著下降，因此PBS緩沖液的離子濃度擬選lOmmol/L。溫度對咖啡酸和阿魏酸的結(jié)合效率也會產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，麥芽糖酶鍵合的磁珠或蔗糖酶鍵合的磁珠與咖啡酸和阿魏酸在37°C達(dá)到最大結(jié)合效率。此外，對孵育時間也進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過30min的孵育，麥芽糖酶鍵合的磁珠或蔗糖酶鍵合的磁珠與咖啡酸和阿魏酸的結(jié)合效率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加孵育時間，結(jié)合效率反而有所下降，這說明孵育30min后，酶表面的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。另外，考察了蠕動泵的轉(zhuǎn)速對咖啡酸和阿魏酸的結(jié)合效率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，蠕動泵的轉(zhuǎn)速從20r/min提高到40r/min,咖啡酸和阿魏酸的結(jié)合效率逐漸升高,進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)速至超過40r/min，結(jié)合效率又下降。綜上所述，優(yōu)化后的條件如下孵育溫度37°C，孵育時間45min，孵育溶劑PBS緩沖液pH為6. 8,離子強(qiáng)度為IOmM,螺動泵轉(zhuǎn)速為40r/min。三、三葉糖脂清中抗糖尿病活性化合物的篩選稱取O. 4g的三葉糖脂清提取物，加入40mL PBS緩沖液(pH 6. 8，離子強(qiáng)度IOmmol/L)，超聲IOmin溶解，作為待篩選溶液。各取100 μ L麥芽糖酶鍵合的磁珠、蔗糖酶鍵合的磁珠、脂肪酶鍵合的磁珠，分別放入三個連通容器中，用蠕動泵將待篩選溶液泵入連通容器中，37°C下循環(huán)孵育30min，用PBS緩沖液清洗3次，每次的清洗液依次進(jìn)液相分析。將清洗液棄去,每個連通容器中加入10%乙腈的水溶液(IOmL)進(jìn)行清洗，洗脫液進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。圖I中，(A)部分為麥芽糖酶磁珠洗脫物，洗脫物總共有6個峰，7個化合物，其中峰4包含兩個化合物，磁珠洗脫物的多級質(zhì)譜及紫外最大吸收波長見表I。這7個化合物分別為芍藥苷(峰1)、2，3，4，6_四沒食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4_四沒食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、異槲皮苷(峰4)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B (峰6)。圖I中，(B)部分為蔗糖酶磁珠洗脫物，洗脫物總共有有6個峰，7個化合物，其中峰4包含兩個化合物。這7個化合物分別為2，3，4，6-四沒食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4_四沒食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、異槲皮苷(峰4)、1，2，3,4,6-五沒食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B(峰6)、未知化合物(峰7)。圖I中，(C)部分為脂肪酶磁珠洗脫物，洗脫物總共有有6個峰，7個化合物，其中峰4包含兩個化合物。這7個化合物分別為2，3，4，6-四沒食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4-四沒食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、異槲皮苷(峰4)、1，2，3，4，6_五沒食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B (峰6)、未知化合物(峰7)。表I磁珠洗脫物的多級質(zhì)譜及紫外最大吸收波長
權(quán)利要求
1.一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，包括 (1)制備鍵合酶磁珠； (2)利用至少兩種鍵合酶磁珠對中藥溶液或天然提取物溶液進(jìn)行選擇性吸附，不同種鍵合酶磁珠上所鍵合的靶標(biāo)蛋白互異，所述的靶標(biāo)蛋白為麥芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶； (3)分離出所有鍵合酶磁珠共同吸附的化合物作為樣本集； (4)通過針對靶標(biāo)蛋白的抑制活性實驗在樣本集中篩選所述的抗糖尿病活性化合物。
2.如權(quán)利要求I所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述的中藥溶液的溶質(zhì)為三葉糖脂清提取物。
3.如權(quán)利要求I所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述制備鍵合酶磁珠的過程為將磁珠清洗干凈，加入活化試劑活化磁珠表面，再次清洗，加入溶解的靶標(biāo)蛋白，孵育，移去上清液，經(jīng)緩沖液沖洗后再加入溶解了牛血清白蛋白的PBS溶液，移去上清液得到鍵合酶磁珠。
4.如權(quán)利要求3所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述磁珠的清洗試劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸的水溶液，濃度為10 50mmol/L，pH為4 8。
5.如權(quán)利要求3所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述磁珠的活化試劑為I-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液，溶液濃度分別為10 80mg/mL, 10 80mg/mL。
6.如權(quán)利要求3所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述孵育的時間為I 5h，溫度為O 25°C。
7.如權(quán)利要求3所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述靶標(biāo)蛋白由25mmol/L、pH為6的2- (N-嗎啡啉)乙磺酸的水溶液溶解，靶標(biāo)蛋白的濃度為O. 5 2mg/mLo
8.如權(quán)利要求I所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述中藥溶液或天然提取物溶液的溶劑為PBS緩沖液，所述PBS緩沖液的離子強(qiáng)度為I 300mmol/L，pH為 5. O 8. O。
9.如權(quán)利要求I所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述選擇性吸附時，將中藥溶液或天然提取物溶液置入一循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)，該循環(huán)反應(yīng)通道內(nèi)具有多個反應(yīng)區(qū)，鍵合有不同靶標(biāo)蛋白的鍵合酶磁珠處于各自對應(yīng)的反應(yīng)區(qū)內(nèi)。
10.如權(quán)利要求9所述的篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，在所述的選擇性吸附過程中，反應(yīng)區(qū)內(nèi)的鍵合酶磁珠浸沒在反應(yīng)通道內(nèi)的中藥溶液或天然提取物溶液中進(jìn)行孵育，所述孵育的時間為10 60min，溫度為20 50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，包括(1)制備鍵合酶磁珠；(2)利用至少兩種鍵合酶磁珠對中藥溶液或天然提取物溶液進(jìn)行選擇性吸附，不同種鍵合酶磁珠上所鍵合的靶標(biāo)蛋白互異，所述的靶標(biāo)蛋白為麥芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶；(3)分離出所有鍵合酶磁珠共同吸附的化合物作為樣本集；(4)通過針對靶標(biāo)蛋白的抑制活性實驗在樣本集中篩選所述的抗糖尿病活性化合物。本發(fā)明篩選抗糖尿病活性化合物的方法可以從中藥或天然產(chǎn)物提取物中針對多靶點(diǎn)或酶篩選抗糖尿病化合物，并應(yīng)用于抗糖尿病藥物的研制，同時減少了傳統(tǒng)方法中初篩時化合物制備分離的步驟，提高了篩選效率、縮短了篩選時間。
文檔編號G01N33/15GK102830209SQ20121033335
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者程翼宇, 王毅 申請人:浙江大學(xué)