專利名稱：用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用多波長吸收同步測量技術實現(xiàn)多種酶活性同步測量方法，具體涉及一種單通道同步測定多波長吸收而同步測量多種酶活性的方法。
背景技術：
定義酶活性測量靈敏度為吸收變化速度對酶量響應曲線斜率，酶活性測量的定量限(limit of quantification, L0Q)為上述響應曲線中直線部分截距加上回歸估計標準差5倍對應酶量。測定酶活性都要求靈敏度盡量高、定量限盡量低而分析效率盡量高。用針對特定酶的高專一性顯色底物可簡便高靈敏度連續(xù)測定吸收變化反應曲線而測定酶活性；這類酶活性測定過程常規(guī)用于臨床生化檢驗、衛(wèi)生檢驗檢測酶抑制劑類食品或環(huán)境污染物、高通量篩選酶抑制劑類組合庫和酶標記免疫分析等。另一方面，酶活性測定 的高特異性和高靈敏度使酶作為標記信號用于免疫分析，代表性技術即酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoassay, ELISA),這是臨床檢驗領域選擇性測定混合物中特定大分子或小分子的最常用方法之一。ELISA應用過程中需用捕獲成分包被微孔板以便分離免疫反應復合物，并需洗滌過程，單次分析常需130min以上，分析效率低。所以，提高酶活性測量效率在應用中有重要意義。連續(xù)跟蹤酶反應曲線測定酶活性都每次使用一個顯色底物測定一種酶活性，即每個反應通道每次只測定一種酶。在臨床檢驗領域經(jīng)常需測定相同標本中的兩種甚至多種酶活性，如測定肝功狀態(tài)需測定相同標本中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、Y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶等，診斷急性胰腺炎時需測定相同標本中的淀粉酶和脂肪酶。另一方面，ELISA技術主要缺點是其分析效率低，單次分析耗時長。再有，篩選酶抑制劑組合化學庫時，每次只測定一種靶酶活性的篩選成本很高而效率低，對組合庫樣品的消耗量大。發(fā)展新技術顯著提高測定酶活性效率，并保障測量酶活性的靈敏度和定量限與單組分測定時相當，無疑有重要意義。提高酶法分析效率的最簡單策略是在一個酶反應體系，即酶反應通道，每次使用多種顯色底物實時同步或基本實時同步地連續(xù)跟蹤多種酶顯色產(chǎn)物吸收變化曲線同步測定多種酶活性。同步測定多波長吸收光度計已普及，如Biotek ELX800酶標儀可同步測量三波長吸收、美譜達UV1600PC普通光度計可同步測定七波長吸收。這些常規(guī)設備同步測定不同波長吸收實際上有較短時差；用有雙單色器或用二極管陣列檢測器的光度計可基本實時同步測量多波長吸收。所以，建立單通道同步測定多種酶的顯色底物組合原理及所需數(shù)據(jù)處理方法，就有望實現(xiàn)單通道多波長吸收同步跟蹤多種酶反應過程同步測量多種酶活性并保障與單組分測定定量限和靈敏度相當，此方法用于ELISA及酶抑制劑高內(nèi)涵篩選都可顯著提高效率。很早報道用兩種酶標記單通道測量兩組分的ELISA技術，但沒有實現(xiàn)單通道兩種酶同步反應和吸收連續(xù)跟蹤。Blake等1982年報道用堿性磷酸酶和β -半乳糖苷酶標記兩種抗原競爭結(jié)合測定單通道同步測定半抗原(Clin Chem 1982; 28 (7) : 1469-1473)。但這兩種酶反應是在不同反應體系進行而非同步進行，且不能連續(xù)跟蹤任一標記酶反應的過程，其使用酚酞單磷酸酯為堿性磷酸酶顯色底物，比活性低于對硝基苯基磷酸酯為顯色底物時比活性的7%而降低了靈敏度，而酚酞單磷酸酯的成本又很高，使得此技術沒有得到實際應用。其它單通道檢測兩組分的ELISA技術中兩種酶反應及兩種酶顯色產(chǎn)物檢測都不同步，也不能連續(xù)跟蹤兩種酶反應曲線(Dean et al.’Clin Chem, 1983; 29 (6) : 1051-1056。Ng, etal.Clin Chem, 1987;33(12):2286-2288。Choi,et al. Clin Chem, 1991;37(5):673-677。Porstmann T,et al.J Tmmunol Methods. 1993;158:95—106。Krambovitis E, et al. Clinchem 1995;41:48-53。Osuchowski,et al. Methods2006;38:304-311 和 Sun J, et al. AnalChim Acta 2010;666:76-82)。因此，現(xiàn)有ELISA技術都未實現(xiàn)單通道同步反應同步連續(xù)跟蹤多種酶顯色顯色產(chǎn)物；在篩選酶抑制劑領域，也沒有實現(xiàn)單通道同步 測量多種酶活性篩選酶抑制劑的報道。顯然，需建立測定酶活性的顯色底物設計組合原理及對應的特殊數(shù)據(jù)處理方法，才可能用常規(guī)設備多波長吸收單通道同步測量多種酶活性。在863項目2011AA02A108資助下，發(fā)明人建立了本發(fā)明權利要求書中所提出的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其基于無相互作用物質(zhì)吸收的線性加和性、酶顯色底物和相應顯色產(chǎn)物的等吸收波長建立所需顯色底物設計和組合應用的新原理，并建立多種物質(zhì)吸收光譜重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，以及消除不同酶的底物與產(chǎn)物之間相互干擾的數(shù)據(jù)處理方法，單通道多波長吸收同步測定多種酶活性。本發(fā)明用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，包括下列步驟a.確定用多波長吸收單通道同步測定多種酶活性所需顯色底物組合al根據(jù)待測酶的專一性篩選滿足下列條件的顯色底物組合所選顯色團能分別用于制備待測酶的顯色底物；所得這些顯色底物組合中，將顯色底物在對應待測酶作用下所得顯色產(chǎn)物相對該顯色底物的差吸收峰最大波長從大到小排列，相鄰的顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長之間相距大于30nm且盡量遠；在按顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長從大到小的排列中，除了顯色產(chǎn)物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物外，每個顯色底物在對應酶作用下所得顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長，都與此排列中某個顯色底物的最大等吸收波長相差小于25nm且盡量短；a2用步驟al所選顯色團分別合成待測酶的對應顯色底物并組合使用；b.在一個反應混合物或酶反應體系即單反應通道中，同步啟動多個待測酶針對組合使用的顯色底物混合物對應顯色底物的專一催化反應；c.選擇測量波長組合以顯色產(chǎn)物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物為顯色底物A，在顯色底物A的顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長下測定該顯色產(chǎn)物吸收；在顯色底物A的等吸收波長處測定其余待測酶顯色產(chǎn)物或顯色底物的吸收；d.在所選多個測量波長組合下，通過快速變換測量波長，多波長吸收同步測量實現(xiàn)同步跟蹤單通道中多個待測酶的反應過程；e.基于無相互作用物質(zhì)吸收的線性加和性建立消除反應通道中顯色物質(zhì)吸收重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，獲得消除吸收光譜重疊干擾后每個待測酶的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾且其底物濃度在對應酶米氏常數(shù)的3倍以上，用經(jīng)典初速度法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾但所用顯色底物濃度在該酶米氏常數(shù)的5%以上而低于米氏常數(shù)的3倍，聯(lián)用經(jīng)典初速度法和反應過程分析法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；當某個待測酶受反應體系中其自身和/或其它酶的底物和/或產(chǎn)物的干擾時，將描述反應體系動力學的微分速度方程組數(shù)值積分后分析活性受到干擾待測酶反應的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線，確定其最大反應速度表示其活性，或據(jù)其微分速度方程和所得最大反應速度換算成底物濃度為起始底物濃度93 %時初速度表示酶活性。進一步，應用該方法時，顯色產(chǎn)物相對顯色底物差吸收峰最大波長在300nm以上且其顯色底物吸收峰最大波長小于相應顯色產(chǎn)物吸收峰最大波長，否則用逆反應測定該酶的活性；對待測酶顯色底物組合中顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長相鄰的任兩個顯色底物，顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長更靠近紅外端者的最大等吸收波長與顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波 長更靠近紫外端者的差吸收峰最大波長相等或相距不超過5nm為優(yōu)化組合；所用顯色底物組合中每個顯色底物都僅被樣品中的一種待測酶作用生成顯色產(chǎn)物，而不被樣品中其它任何酶作用或作用效果不明顯；此處所述不被其它任何酶作用或作用效果不明顯，指當樣品中酶I所對應顯色底物的濃度與其米氏常數(shù)相差小于50%時，樣品中其它任何酶作用于該顯色底物的比活性都低于酶I作用于該顯色底物比活性的1%;權利要求I的步驟b中，選擇適于同步測定活性的待測酶發(fā)揮作用的緩沖介質(zhì)和反應條件，具體包括緩沖介質(zhì)PH位于pH 5.0到9. O之間且接近比活性最低待測樣品的最適pH，所用樣品反應溫度在攝氏20到40度之間。進一步，該方法應用時所述顯色底物包括天然顯色底物和非天然顯色底物；天然顯色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然顯色底物由顯色團和被酶識別基團組成，顯色團包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-I-萘酚、4-硝基-I-萘硫酚、4-硝基-I-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫紅酸或其衍生物。進一步，該方法應用于同步測量兩種酶活性，步驟a中，所述樣品中含兩種待測酶分別命名為酶A和酶B，所需兩種顯色底物分別命名為顯色底物A和顯色底物B，在兩種待測酶作用下生成兩種顯色產(chǎn)物分別命名為顯色產(chǎn)物A和顯色產(chǎn)物B，這些顯色底物及顯色產(chǎn)物的組合需滿足下列條件(I)顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl靠近紅外端，顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2靠近紫外端，顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2與顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl相距大于30nm且盡量遠；(2)顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長為Yl且與顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2相距小于25nm且且盡量短。該方法應用于同步測量兩種酶活性的步驟b和c及d中，在一個反應通道同步啟動樣品中兩種酶針對顯色團A和顯色團B合成的對應顯色底物A和顯色底物B的反應，并得到顯色產(chǎn)物A和顯色產(chǎn)物B ；以顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長Yl為λ 2處測定顯色產(chǎn)物B吸收，以顯色產(chǎn)物A的差吸收峰最大波長Xl為λ I處測定顯色產(chǎn)物A吸收；通過快速變換測量波長，兩波長吸收同步測量實現(xiàn)同步跟蹤單個反應體系中兩種待測酶的反應過程。
該方法應用于同步測量兩種酶活性的步驟e中，基于吸收線性加和性建立數(shù)據(jù)解析消除多種物質(zhì)吸收重疊干擾方法；以顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長前后不超過25nm的波長為λ I且在此波長下吸收為Al，以顯色產(chǎn)物A和顯色底物A最大等吸收波長附近不超過25nm的波長為λ 2且此波長下吸收為A2，基于吸收線性加和性消除物質(zhì)吸收重疊干擾需解如下二元一次方程組=A1=Altl + Ε31ΧΡ1+Ε34ΧΡ2
A2=A20 E32 X PJE35 X P2進一步可轉(zhuǎn)變成如下二元一次方程組A1=Altl + Ala+R33 X A2b A2=A20 + A2b+R31 XAlaR31=E32/E31R33=E34/E35P1為顯色產(chǎn)物A瞬時濃度；P2為顯色產(chǎn)物B瞬時濃度；E31為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ I下差摩爾消光系數(shù)；Ε32為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ 2下差摩爾消光系數(shù)Ε32 ；Ε34為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ I下差摩爾消光系數(shù)；Ε35為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ 2下差摩爾消光系數(shù)夂為校正吸收干擾前在λ I瞬時總吸收，A2為校正吸收干擾前在λ 2瞬時總吸收；Ala為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物A在λ I瞬時凈吸收，其等于P1和Ε31乘積，A2b為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物B在λ 2瞬時凈吸收，其等于P2和Ε35乘積；Altl為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ I的吸收,為來自反應體系的本底,相當于含相同濃度全部顯色底物反應體系在λ I吸收與含相同濃度樣品反應體系在λ I吸收的加和；A2tl為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ 2的吸收,為來自反應體系的本底,相當于含濃度相同全部顯色底物的反應體系在λ 2吸收與含相同濃度樣品反應體系在λ 2吸收的加和；當僅某種酶顯色產(chǎn)物對另一種酶有競爭抑制作用時，確定顯色產(chǎn)物A及顯色產(chǎn)物B在λ 下和在λ2下的無干擾吸收變化曲線Ala和A2b;設初始顯色底物A的濃度為Cl，初始顯色底物B的濃度為C2 ;設酶B最大反應速度為VmB，由Vnfi換算成初速度所用預設顯色底物濃度等于C2的93%，酶B對顯色底物B的米氏常數(shù)為KmB ;如顯色產(chǎn)物A對酶B為競爭性抑制，其競爭性抑制常數(shù)為Kia，酶B動力學方程為
權利要求
1.一種用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于包括下列步驟 a.確定用多波長吸收單通道同步測定多種酶活性所需顯色底物組合 al根據(jù)待測酶的專一性篩選滿足下列條件的顯色底物組合所選顯色團能分別用于制備待測酶的顯色底物；所得這些顯色底物組合中，將顯色底物在對應待測酶作用下所得顯色產(chǎn)物相對該顯色底物的差吸收峰最大波長從大到小排列，相鄰的顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長之間相距大于30nm且盡量遠；在按顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長從大到小的排列中，除了顯色產(chǎn)物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物外，每個顯色底物在對應酶作用下所得顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長，都與此排列中某個顯色底物的最大等吸收波長相差小于25nm且盡量短； a2用步驟al所選顯色團分別合成待測酶的對應顯色底物并組合使用； b.在一個反應混合物或酶反應體系即單反應通道中，同步啟動多個待測酶針對組合使用的顯色底物混合物對應顯色底物的專一催化反應； c.選擇測量波長組合以顯色產(chǎn)物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物為顯色底物A，在顯色底物A的顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長下測定該顯色產(chǎn)物吸收；在顯色底物A的等吸收波長處測定其余待測酶顯色產(chǎn)物或顯色底物的吸收； d.在所選多個測量波長組合下，通過快速變換測量波長，多波長吸收同步測量實現(xiàn)同步跟蹤單通道中多個待測酶的反應過程； e.基于無相互作用物質(zhì)吸收的線性加和性建立消除反應通道中顯色物質(zhì)吸收重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，獲得消除吸收光譜重疊干擾后每個待測酶的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾且其底物濃度在對應酶米氏常數(shù)的3倍以上，用經(jīng)典初速度法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾但所用顯色底物濃度在該酶米氏常數(shù)的5%以上而低于米氏常數(shù)的3倍，聯(lián)用經(jīng)典初速度法和反應過程分析法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；當某個待測酶受反應體系中其自身和/或其它酶的底物和/或產(chǎn)物的干擾時，將描述反應體系動力學的微分速度方程組數(shù)值積分后分析活性受到干擾待測酶反應的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線，確定其最大反應速度表示其活性，或據(jù)其微分速度方程和所得最大反應速度換算成底物濃度為起始底物濃度93 %時初速度表示該待測酶的活性。
2.根據(jù)權利要求I所述用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于顯色產(chǎn)物相對顯色底物差吸收峰最大波長在300nm以上且其顯色底物吸收峰最大波長小于其對應顯色產(chǎn)物吸收峰最大波長，否則測定該酶催化逆反應的速度表示該酶的活性；顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長相鄰的任兩個顯色底物中，顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長更靠近紅外端顯色底物的最大等吸收波長與顯色產(chǎn)物差吸收峰最大波長更靠近紫外端顯色產(chǎn)物的差吸收峰最大波長相等或相距不超過5nm為優(yōu)化的顯色底物組合；所用顯色底物組合中每個顯色底物都僅被樣品中的一種待測酶作用生成對應顯色產(chǎn)物，而不被樣品中其它任何酶作用或作用效果不明顯；步驟b中，選擇適于同步測定活性的待測酶發(fā)揮作用的緩沖介質(zhì)和反應條件，即緩沖介質(zhì)PH位于pH 5. O到9. O之間且接近比活性最低待測樣品的最適PH，所用反應溫度在攝氏20到40度之間。
3.根據(jù)權利要求2所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于所述顯色底物包括天然顯色底物和非天然顯色底物；天然顯色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然顯色底物由顯色團和被酶識別基團組成，顯色團包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-I-萘酚、4-硝基-I-萘硫酚、4-硝基-I-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫紅酸或這些芳香酚及芳香胺的衍生物。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于采用兩波長吸收單通道同步測量兩種酶活性 步驟a中，將兩種待測酶分別命名為酶A和酶B，所需兩種顯色團分別為顯色團A和顯色團B，對應的兩種顯色底物分別為顯色底物A和顯色底物B，在兩種待測酶作用下生成的兩種顯色產(chǎn)物分別為顯色產(chǎn)物A和顯色產(chǎn)物B，這些顯色底物及顯色產(chǎn)物的組合需滿足下列條件(I)顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl靠近紅外端，顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2靠近紫外端，顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2與顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl相距大于30nm且盡量遠；(2)顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長為Yl且與顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2相距小于25nm且盡量短； 步驟b、c和d中，在一個反應通道同步啟動樣品中兩種酶針對顯色底物A和顯色底物B的反應，并得到顯色產(chǎn)物A和顯色產(chǎn)物B ;選擇顯色產(chǎn)物A的差吸收峰最大波長Xl為λ I測定顯色產(chǎn)物A吸收，選擇顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長Yl為λ 2處測定顯色產(chǎn)物B吸收；通過快速變換測量波長，兩波長吸收同步測量同步跟蹤單通道中兩種待測酶的反應過程；步驟e中，基于吸收的線性加和性建立消除多種物質(zhì)吸收重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，獲得消除吸收光譜重疊后兩個待測酶的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾且其底物濃度在對應酶米氏常數(shù)的3倍以上，則用經(jīng)典初速度法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾但所用底物濃度在該酶米氏常數(shù)的5%以上而低于米氏常數(shù)的3倍，聯(lián)用經(jīng)典初速度法和反應過程分析法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；當某個待測酶受到反應體系中其自身或其它酶的底物或產(chǎn)物的干擾時，將描述反應體系動力學的微分速度方程組數(shù)值積分后分析活性受到干擾待測酶反應的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線，確定其最大反應速度表示其活性，或據(jù)其微分速度方程和所得最大反應速度換算成底物濃度為起始底物濃度93%時初速度表示酶活性；以顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長前后不超過25nm的波長為λ I并測定在此波長下吸收為Al，以顯色產(chǎn)物A和顯色底物A最大等吸收波長附近不超過25nm的波長為λ 2下并測定此波長下吸收為Α2，基于吸收線性加和性消除多種物質(zhì)吸收重疊干擾計算無干擾的顯色產(chǎn)物或底物吸收，需解下列二元一次方程組A1=A10 + Ε31ΧΡ1+Ε34ΧΡ2A2=A20 Ε32 X PJE35 X P2 進一步可轉(zhuǎn)變成如下二元一次方程組A1=A10 + Ala+R33XA2bA2=A20 + A2b+R31 XAla 其中R31=E32/E31R33=E34/E35 上述公式中，P1為顯色產(chǎn)物A瞬時濃度；P2為顯色產(chǎn)物B瞬時濃度；E31為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ I下差摩爾消光系數(shù)；Ε32為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ 2下差摩爾消光系數(shù)Ε32 ；Ε34為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ I下差摩爾消光系數(shù)；Ε35為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ 2下差摩爾消光系數(shù)A1為校正吸收干擾前在λ I瞬時總吸收，A2為校正吸收干擾前在λ 2瞬時總吸收；Ala為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物A在λ I瞬時凈吸收，其等于P1和Ε31乘積，A2b為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物B在λ 2瞬時凈吸收，其等于P2和Ε35乘積汸1(|為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ I的吸收,為來自反應體系的本底,相當于含相同濃度全部顯色底物反應體系在λ I吸收與含相同濃度樣品反應體系在λ I吸收的加和；八2(|為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ 2的吸收,為來自反應體系的本底,相當于含濃度相同全部顯色底物的反應體系在λ 2吸收與含相同濃度樣品反應體系在λ 2吸收的加和； 上述計算公式中，酶A將顯色底物A轉(zhuǎn)變成顯色產(chǎn)物A的計量關系為1: 1，酶B將顯色底物B轉(zhuǎn)變成顯色產(chǎn)物B的計量關系也為1:1; 如反應通道中某種酶的底物或產(chǎn)物抑制或激活另一種酶，則如下測量被干擾酶活性 獲得兩種顯色底物或顯色產(chǎn)物的無干擾吸收變化曲線，據(jù)此換算出產(chǎn)生干擾作用物質(zhì)的濃度變化曲線；用含干擾作用微分動力學方程數(shù)值積分計算理論反應曲線擬合被干擾酶顯色底物或顯色產(chǎn)物的無干擾吸收變化曲線，對應最好擬合的最大反應速度Vm為無干擾時的待測酶活性；據(jù)該酶的微分動力學方程、Vm和其初始底物濃度的93%，計算在剛啟動反應時干擾物質(zhì)還沒有明顯積累的初速度表示該待測酶活性； 當僅一種酶顯色產(chǎn)物對另一種酶有競爭抑制作用時，先確定顯色產(chǎn)物A及顯色產(chǎn)物B在λ 下和在λ2下的無干擾吸收變化曲線Ala和A2b;設初始顯色底物A的濃度為Cl，初始顯色底物B的濃度為C2 ;設酶B最大反應速度為VmB，由Vnfi換算成初速度所用預設顯色底物濃度等于C2的93%，酶B對顯色底物B的米氏常數(shù)為KmB ;如顯色產(chǎn)物A對酶B為競爭性抑制，其競爭性抑制常數(shù)為Kia，酶B動力學方程為
5.根據(jù)權利要求4所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，特征在于 步驟a中，如下選擇顯色團A和顯色團B組合顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長Yl與顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2相等或相距不超過5nm ； 步驟c中，選擇產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl為λ I后，如下選擇測量波長λ 2 :顯色產(chǎn)物B與顯色底物B差摩爾消光系數(shù)在顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl處高于在顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長Χ2處的30%，則選擇顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl為λ 2，否則，用最靠近顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl的顯色產(chǎn)物B差吸收峰波長為λ 2，或最靠近顯色產(chǎn)物B差吸收峰且其它待測顯色顯色產(chǎn)物與顯色顯色底物差摩爾消光系數(shù)都小于顯色產(chǎn)物B與顯色底物B差摩爾消光系數(shù)20%的波長為λ 2測量顯色產(chǎn)物B吸收； 步驟e中，需測定R31為顯色產(chǎn)物A吸收干擾的校正系數(shù)；測定R31時，僅用酶A所需的全部顯色底物而不加其它待測酶的任何顯色底物，使反應體系無來自顯色底物B及顯色產(chǎn)物B在兩個測量波長λ I和λ 2的吸收，此時同步測定反應通道中在兩個測量波長下的吸收變化，直到在λ 2吸收變化大于O. 005或在λ I吸收變化大于O. 500 ;以在λ I下吸收為橫坐標，在λ 2下吸收為縱座標進行回歸分析，所得回歸直線斜率為校正系數(shù)R31 ； 步驟e中，需測定R33為顯色產(chǎn)物B吸收干擾的校正系數(shù)；測定R33時，僅用酶B所需的全部顯色底物而不加其它待測酶的任何顯色底物，使反應體系無來自顯色底物A及顯色產(chǎn)物A在兩個測量波長λ I和λ 2的吸收，此時同步測定反應通道中在兩個測量波長下的吸收變化，直到在λ 2吸收變化大于O. 500或在λ I吸收變化大于O. 005 ;以在λ 2下吸收為橫坐標，在λ I下吸收為縱座標進行回歸分析，所得回歸直線斜率為校正系數(shù)R33。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于 與酶A對應的顯色底物包括水解反應最大等吸收波長在310到330nm間的4-硝基苯基乙酸酯，水解反應最大等吸收波長在330到350nm間的4-硝基苯基磷酸酯、4-硝基苯基硫酸酯、4-硝基苯基-β -D-半乳糖苷和Y -谷氨酰基-4-硝基苯胺，還原反應最大等吸收波長在350到370nm間的5-巰基-2-硝基苯甲酸及5-巰基-2-硝基苯乙酸對應顯色底物為二硫化物可被酶作用所釋放的硫醇還原；與此類酶A的顯色底物A對應的酶B的顯色底物B主要是天然顯色底物，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 與顯色底物A對應的酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、Y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶、天然氨基酸α-羧基對應的酰胺酶和糖苷酶；與此類酶A對應的酶B包括但不限于乳酸脫氫酶LDH、蘋果酸脫氫酶MDH、偶聯(lián)LDH的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和偶聯(lián)MDH的谷草轉(zhuǎn)氨酶。
7.根據(jù)權利要求1、2或3所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于采用三波長吸收單通道同步測量三種酶活性 步驟a中，將三種待測酶分別命名為酶A、酶B和酶C，所需顯色底物分別為顯色底物A、顯色底物B和顯色底物C，在對應酶作用下生成顯色產(chǎn)物分別為顯色產(chǎn)物A、顯色產(chǎn)物B和顯色產(chǎn)物C ;這些顯色底物和顯色產(chǎn)物的組合需滿足下列條件(I)顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長為Xl且最靠近紅外端，顯色產(chǎn)物C差吸收峰最大波長為X3且最靠近紫外端，顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長為X2且位于Xl和X3之間，X2與Xl及X3相距都大于30nm且盡量遠；(2)顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長為Yl且次大等吸收波長為Ys ;顯色底物B生成顯色產(chǎn)物B的最大等吸收波長為Y2且與Yl相距盡量遠而和Ys相距盡量短；(3) Yl與X2相距小于25nm且相距盡量短；Y2和Ys及Χ3相距都小于25nm且相距盡量短； 步驟b中，在一個反應通道同步啟動三種酶針對顯色底物A、顯色底物B和顯色底物C的反應，并得到對應的顯色產(chǎn)物A、顯色產(chǎn)物B和顯色產(chǎn)物C ； 步驟c中，以顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl或相距25nm以內(nèi)波長為λ I測定顯色產(chǎn)物A吸收，選擇顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl或相距25nm以內(nèi)波長為λ 2測定顯色產(chǎn)物B吸收，選擇顯色產(chǎn)物B最大等吸收波長Υ2或相距25nm以內(nèi)波長為λ 3測定顯色產(chǎn)物C吸收； 步驟d中，通過快速變換測量波長，三波長吸收同步測量實現(xiàn)同步跟蹤單個反應體系中兩種樣品的反應過程； 步驟e中，先建立消除多種物質(zhì)吸收重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，獲得消除吸收光譜重疊后每個待測酶的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線；某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾且其底物濃度在對應酶米氏常數(shù)的3倍以上，則用經(jīng)典初速度法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產(chǎn)物及底物的干擾但所用底物濃度在該酶米氏常數(shù)的5%以上而低于米氏常數(shù)的3倍，聯(lián)用經(jīng)典初速度法和反應過程分析法分析其顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；當某個待測酶受到反應體系中其自身或其它酶的底物或產(chǎn)物的干擾時，將描述反應體系動力學的微分速度方程組數(shù)值積分后分析活性受到干擾待測酶反應的顯色產(chǎn)物或顯色底物無干擾吸收變化曲線，確定其最大反應速度表示其活性，或據(jù)其微分速度方程和所得最大反應速度換算成底物濃度為起始底物濃度93%時初速度表示酶活性；基于吸收線性加和性消除多種物質(zhì)吸收重疊干擾需解如下三元一次方程組 A1=A10 + Ala+R33 X A2b+R35 X A3c A2=A20 + A2b+R31 X Ala+R36 X A3c A3=A30 + ASc+R32 X Ala+R34 X A2b 其中R31=E32/E31R32=E33/E31R33=E34/E35R34=E36/E35 R35=E37/E39R36=E38/E39 上述公式中，A1為校正吸收干擾前在λ I瞬時吸收，A2為校正吸收干擾前在λ 2瞬時吸收，A3為校正吸收干擾前在λ 3瞬時吸收;Ala為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物A在λ I瞬時凈吸收，A2b為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物B在λ 2瞬時凈吸收，Α3。為校正吸收干擾后顯色產(chǎn)物C在λ 3瞬時凈吸收；Α1(Ι為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ I吸收，A20為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ 2吸收，A30為反應體系未生成任何顯色產(chǎn)物前在λ 3吸收；Ε31為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ I下差摩爾消光系數(shù)，Ε32為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ 2下差摩爾消光系數(shù)，Ε33為顯色產(chǎn)物A與顯色底物A在λ 3下差摩爾消光系數(shù)；Ε34為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ I下差摩爾消光系數(shù)，Ε35為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ 2下差摩爾消光系數(shù)，Ε36為顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在λ 3下差摩爾消光系數(shù)；Ε37為顯色產(chǎn)物C與顯色底物C在測量波長λ I下差摩爾消光系數(shù)，Ε38為顯色產(chǎn)物C與顯色底物C在測量波長λ 2下差摩爾消光系數(shù)，Ε39為顯色產(chǎn)物C與顯色底物C在測量波長λ 3下差摩爾消光系數(shù)；上述公式中，顯色底物A轉(zhuǎn)變成顯色產(chǎn)物A計量關系為I: I ;顯色底物B轉(zhuǎn)變成顯色產(chǎn)物B的計量關系為I: I ;顯色底物C轉(zhuǎn)變成顯色產(chǎn)物C的計量關系為1:1; 如反應通道中某種酶的底物或產(chǎn)物抑制或激活另一種酶，則如下測量被干擾酶活性 獲得兩種顯色底物或顯色產(chǎn)物的無干擾吸收變化曲線，據(jù)此換算出產(chǎn)生干擾作用物質(zhì)的濃度變化曲線；用含干擾作用微分動力學方程數(shù)值積分計算理論反應曲線擬合被干擾酶顯色底物或顯色產(chǎn)物的無干擾吸收變化曲線，對應最好擬合的最大反應速度Vm為無干擾時的待測酶活性；據(jù)該酶的微分動力學方程、Vm和其初始底物濃度的93%，計算在剛啟動反應時干擾物質(zhì)還沒有明顯積累的初速度表示該待測酶活性； 當僅一種酶顯色產(chǎn)物對另一種酶有競爭抑制作用時，先確定顯色產(chǎn)物A及顯色產(chǎn)物B在λ 下和在λ2下的無干擾吸收變化曲線Ala和A2b;設初始顯色底物A的濃度為Cl，初始顯色底物B的濃度為C2 ;設酶B最大反應速度為VmB，由Vnfi換算成初速度所用預設顯色底物濃度等于C2的93%，酶B對顯色底物B的米氏常數(shù)為KmB ;如顯色產(chǎn)物A對酶B為競爭性抑制，其競爭性抑制常數(shù)為Kia，酶B動力學方程為
8.根據(jù)權利要求7所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于采用三波長吸收單通道同步測量三種酶活性 步驟a中，可用如下原則選擇顯色底物組合所用顯色底物A、顯色底物B及顯色底物C使顯色產(chǎn)物A的最大等吸收波長Yl與顯色產(chǎn)物B差吸收峰最大波長X2相等或相距不超過5nm、顯色產(chǎn)物B最大等吸收波長Y2和顯色產(chǎn)物A次大等吸收波長Ys及顯色產(chǎn)物C差吸收峰最大波長X3之間相等或任兩者相距都不超過5nm ； 步驟c中，選擇顯色產(chǎn)物A差吸收峰最大波長Xl為λ I后，按如下原則選擇另外兩個測量波長λ 2和λ 3 :顯色產(chǎn)物B與顯色底物B差摩爾消光系數(shù)在顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl處高于顯色產(chǎn)物B與顯色底物B在二者差吸收峰最大波長Χ2處差摩爾消光系數(shù)的30%時，選擇Yl為測量波長λ 2，否則，用最靠近顯色產(chǎn)物A最大等吸收波長Yl的顯色產(chǎn)物B差吸收峰波長，或靠近顯色產(chǎn)物B差吸收峰且其它顯色產(chǎn)物與顯色顯色底物差摩爾消光系數(shù)都小于顯色產(chǎn)物B與顯色底物B差摩爾消光系數(shù)20%的波長為λ 2測量顯色產(chǎn)物B吸收；顯色產(chǎn)物C與顯色底物C差摩爾消光系數(shù)在顯色產(chǎn)物A次大等吸收波長Ys處或顯色產(chǎn)物B與顯色底物B最大等吸收波長Υ2處應高于二者在其差吸收峰最大波長Χ3處差摩爾消光系數(shù)的30%時，則選擇Υ2或Ys為為λ 3測量顯色產(chǎn)物B吸收，否則用最靠近顯色產(chǎn)物B最大等吸收波長Υ2或顯色產(chǎn)物A次大等吸收波長Ys或靠近顯色產(chǎn)物C差吸收峰最大波長且其它顯色產(chǎn)物與顯色底物差摩爾消光系數(shù)都小于顯色產(chǎn)物C與顯色底物C差摩爾消光系數(shù)20%的波長為λ 3測量顯色產(chǎn)物C吸收； 步驟e中需測定顯色產(chǎn)物A吸收干擾校正系數(shù)R31和R32 ;測定時僅用酶A的全部顯色底物而不用其它待測酶的任何顯色底物，使反應體系無來自顯色底物B及顯色產(chǎn)物B、顯色底物C及顯色產(chǎn)物C在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步測定反應通道中三個波長下的吸收變化，直到在λ 2及λ 3吸收變化都大于O. 005或在λ I吸收變化大于O. 500 ;以在λ I下吸收變化為橫坐標，在λ 2下和在λ 3下吸收變化為縱座標進行回歸分析，所得在λ 2下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R31，在λ 3下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R32 ；步驟e中需測定顯色產(chǎn)物B吸收干擾校正系數(shù)R33和R34 ;測定時僅用酶B的全部顯色底物而不用其它待測酶的任何顯色底物，使反應體系無來自顯色底物A及顯色產(chǎn)物A、顯色底物C及顯色產(chǎn)物C在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步測定反應通道中三個波長下的吸收變化，直到在λ 2及λ 3吸收變化都大于O. 005或在λ I吸收變化大于O. 500 ;以在λ 2下吸收變化為橫坐標，在λ I下和在λ 3下吸收變化為縱座標進行回歸分析，所得在λ I下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R33，在λ 3下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R34 ；步驟e中需測定顯色產(chǎn)物C吸收干擾校正系數(shù)R35和R36 ;測定時僅用酶C的全部顯色底物而不用其它待測酶的任何顯色底物，使反應體系無來自顯色底物A及顯色產(chǎn)物A、顯色底物B及顯色產(chǎn)物B在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步測定反應通道中三個波長下的吸收變化，直到在λ 2及λ I吸收變化都大于O. 005或在λ 3吸收變化大于O. 500 ;以在λ 3下吸收變化為橫坐標，在λ I下和在λ 2下吸收變化為縱座標進行回歸分析，所得在λ I下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R35，在λ 2下吸收變化回歸直線斜率為校正系數(shù)R36。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于 步驟a中，與酶A對應顯色底物A包括4-硝基-I-萘基磷酸酯且其水解兩個等吸收波長分別在315到335nm之間及395到415nm之間、4-硝基-I-萘基硫酸酯且其水解兩個等吸收波長分別在315到335nm之間及395到415nm之間、4-硝基-I-萘基乙酸酯且其水解時兩個等吸收波長分別在310到330nm之間及375到395nm之間、4-硝基-I-萘基-D-半乳糖苷且其水解時兩個等吸收波長分別在320到345nm之間及390到410nm之間、4-硝基-I- (N-賴氨酰)萘胺且其水解的最大等吸收波長分別在385到410nm之間，這些顯色底物A被酶A作用生成4-硝基-I-萘酚或4-硝基-I-萘胺或其衍生物作為顯色產(chǎn)物A ;與此類顯色底物A對應的顯色底物B主要是4-硝基苯酚或4-硝基苯胺衍生物，在相應的酶B作用下生成顯色產(chǎn)物B為4-硝基苯酚或4-硝基苯胺或4-硝基苯基硫醇；與此類顯色底物A和顯色底物B對應的顯色底物C包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 與顯色底物A對應酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、Y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶、肽酶即天然氨基酸α -羧基對應的酰胺酶和糖苷酶；與顯色底物B對應的酶B包括與已選酶A不同但屬于酶A的其它水解酶；與顯色底物C對應的酶包括但不限于乳酸脫氫酶LDH、蘋果酸脫氫酶MDH、偶聯(lián)LDH的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和偶聯(lián)MDH的谷草轉(zhuǎn)氨酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法；基于光吸收線性加和性及酶顯色底物與其對應顯色產(chǎn)物的等吸收波長，建立多波長吸收同步測量單通道同步測定多種酶活性所需顯色底物組合設計原理及消除吸收光譜重疊干擾的數(shù)據(jù)處理方法，并以數(shù)值積分的速度方程分析酶反應過程測定最大反應速度消除各種底物及產(chǎn)物對待測酶活性的干擾，使單通道同步測定多種酶活性的范圍及檢測限都與單獨測定時相當；該方法可用于同步測定生物樣品多種酶活性、酶標記免疫分析同步測定多組分含量、同步篩選不同靶酶的抑制劑，可用于臨床生化分析和臨床免疫檢驗、衛(wèi)生檢驗、酶抑制劑篩選等常規(guī)實踐，也可用于這類酶法分析技術適用的各種基礎研究。
文檔編號G01N21/31GK102879343SQ20121035560
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權日2012年9月21日
發(fā)明者廖飛, 楊曉蘭, 劉紅博, 黨濟政, 龍高波, 李元麗, 劉霖 申請人:重慶醫(yī)科大學