專利名稱：一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光光譜快速同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹含量的方法，屬于乳制品快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著我國居民收入的提高和對乳制品消費觀念的轉(zhuǎn)變，食用乳制品的消費者人數(shù)逐年增加，我國的乳制品行業(yè)得到迅猛發(fā)展。然而從目前國內(nèi)奶業(yè)的生產(chǎn)和加工狀況來看，我國乳制品的質(zhì)量與安全現(xiàn)狀不容樂觀。首先由于我國乳牛的農(nóng)場化養(yǎng)殖水平較低，大部分原料乳(約占80%)是來自乳牛散養(yǎng)戶，因此導(dǎo)致原料乳品質(zhì)波動性很大。同時存在的乳中摻假、濫用抗生素等諸多問題也使得乳制品安全性存在重大隱患。·抗生素是由細菌、霉菌或其它微生物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類物質(zhì)。自1940年青霉素首次應(yīng)用于臨床起，抗生素的種類已達幾千種。而臨床上常用的約有幾百種?？股卦谀膛ｏ曫B(yǎng)業(yè)中被廣泛使用醫(yī)療乳房炎等疾病。由于抗生素在常壓下不受物理方法的破壞，因此如果對奶牛用藥不當(dāng)或濫用抗生素，牛乳中就會發(fā)生抗生素殘留現(xiàn)象，并進一步轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)。長期食用殘留有抗生素的食品會引起人體的過敏、肝腎損傷等毒副作用。單諾沙星(DANO)是一種具有廣譜抗菌活性的合成抗生素，它屬于喹諾酮類藥物的衍生物-氟喹諾酮類。氟甲喹(FLU)也是抗菌性的藥物，屬于喹諾酮類藥物。它們的機理是作用是抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，從而阻止細菌的代謝繁殖。目前，這兩種抗生素已經(jīng)被廣泛用于食用動物的治療、防治疾病從而增加動物的產(chǎn)量，但是過量使用或使用不當(dāng)會造成動物源性產(chǎn)品的藥物殘留，會對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及關(guān)節(jié)等造成危害，從而引起人們廣泛關(guān)注。隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，喹諾酮類抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛應(yīng)用，牛乳中抗生素的殘留問題也隨之而來，其不僅會對人的健康帶來很大危害，而且對乳制品企業(yè)帶來經(jīng)濟損失，因此嚴(yán)格控制牛奶中的抗生素殘留量是很重要的一步。歐盟對鮮牛乳中四種喹諾酮類抗生素的殘留量已經(jīng)有明確的規(guī)定，單諾沙星(30μ g/kg)、氟甲喹(50 μ g/kg)、恩諾沙星(100 μ g/kg)和麻保沙星(μ g/kg)等。目前，牛乳中抗生素殘留量的檢測方法主要有微生物檢測法(TTC法、紙片法等)、理化檢測法(HPLC法、LC-MASS法等)和免疫學(xué)分析法(ELISA法等)，但這些方法各自都有一定的缺點。微生物檢測法的缺點是檢測周期長，操作復(fù)雜等；理化檢測法的缺點是前處理繁冗，耗時長等；免疫檢測法則是對試劑選擇性高，很難同時分析多種成分，對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度生物交叉反應(yīng)等。在眾多分析方法中，熒光光譜法因其快捷簡便、高靈敏度等優(yōu)點而成為很好的選擇，國外也已有學(xué)者利用此方法對牛乳中單組分抗生素(DANO)殘留量進行檢測分析，但并沒有對牛乳中DANO和FLU兩種抗生素的同時檢測的報道，所以本發(fā)明采用熒光光譜法實現(xiàn)對牛乳中的DANO和FLU進行同時檢測。對于本發(fā)明所研究的兩種抗生素而言，因其具有熒光基團，在吸收光后能放射出熒光，所以使得熒光光譜法檢測喹諾酮抗生素成為可能。單諾沙星(DANO)與氟甲喹(FLU)都屬于喹諾酮類藥物，單諾沙星在激發(fā)波長(λΘΧ)/發(fā)射波長(Xem)為280/440nm時出現(xiàn)最高熒光峰；氟甲喹的熒光出峰位置則在激發(fā)波長/發(fā)射波長為320/360nm。但是由于牛奶體系較為復(fù)雜，含有許多具有熒光性的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)(λΘΧ/λ_=290/320ηπι)、維生素 A ( λ ex/ λ em=321/410nm)、美拉德產(chǎn)物(λ ex/ λ em=360/410nm)和核黃素(λ ex/λ em=360/410nm)等化合物，這些熒光物質(zhì)會與所研究的抗生素的熒光信號發(fā)生光譜重疊，尤其是熒光強度高的蛋白質(zhì)對分析物的熒光信號影響特別嚴(yán)重，所以去除蛋白是本文中必要的一步。再應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)的方法對熒光光譜圖進行處理解析之后，就可排除其它熒光組分的干擾(美拉德產(chǎn)物等)，建立最佳校正模型和快速檢測方法。本文中共采用了兩種計量學(xué)方法偏最小二乘法回歸(PLS2)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。偏最小二乘法主要是用于定量分析，對未知樣品中的某種組分含量進行預(yù)測，它在分解光譜矩陣時同時考慮了濃度矩陣的影響。偏最小二乘判別分析法主要是用于定性分析，判別單個未知樣品與已知樣品組之間的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種利用熒光光譜并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法，建立快速且同時檢測牛乳中單諾沙星和氟甲喹殘留量的方法。一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，包括以下步驟(I)校正集樣本的收集在不含單諾沙星與氟甲喹的牛奶樣本中加入不同量的單諾沙星與氟甲喹，使牛奶體系中單諾沙星的濃度在0-56 μ g L-1范圍內(nèi)，氟甲喹的濃度在0-100 μ g Γ1范圍內(nèi)，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)，收集澄清的校正集樣本；(2)校正集樣本熒光光譜的測定使用熒光分光光度計掃描樣本，獲取熒光光譜數(shù)據(jù)；(3)校正模型的建立利用多元校正化學(xué)計量學(xué)方法，分別構(gòu)建校正集樣本中單諾沙星與氟甲喹含量與熒光光譜數(shù)據(jù)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，用于樣本單諾沙星與氟甲喹含量的預(yù)測并判斷出陰性與陽性樣品； (4)校正模型的驗證取已知單諾沙星與氟甲喹含量的牛奶驗證集樣本，在與步驟(2)中相同條件下掃描獲取熒光光譜數(shù)據(jù)，根據(jù)已建立的校正模型計算樣本中單諾沙星與氟甲喹含量以及對陰性與陽性樣本進行分類；(5)校正模型的應(yīng)用采集待測樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)，獲取特征光譜信息，將該光譜信息輸入已建立的校正模型中，篩選出陰性樣本并計算出牛奶樣本中單諾沙星與氟甲喹的含量。所述的步驟(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)的方法為加入濃度為50% (w/V)的三氯乙酸，至蛋白質(zhì)沉淀，靜置5min,離心,過濾。所述的步驟(2)中熒光光譜數(shù)據(jù)的采集條件為以320nm為激發(fā)波長，以330-530nm為發(fā)射波長范圍，以5nm為激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度，以1200nm/min為進行光譜掃描速度，每個樣本作3次平行掃描，取平均掃描數(shù)據(jù)作為樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)。所述的多元校正化學(xué)計量學(xué)方法為偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS),使用的計算機軟件為Unscrambler軟件。所述的陰性牛奶樣本為牛奶體系中單諾沙星含量小于最大殘留量30 μ gL—1、氟甲喹含量小于最大殘留量50 μ g L—1的樣本；所述的陽性樣本為牛奶體系中單諾沙星含量大于最大殘留量30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大殘留量50 μ gL—1的樣本。本發(fā)明的有益效果采用PLSDA分析可以得到很好的結(jié)果，它可以同時且正確地將抗生素含量在最大殘留量上下的樣本分類。而采用PLS回歸分析可以對未知樣本中抗生素的含量進行預(yù)測，且兩個抗生素的平均回收率為101%和97%。采用本發(fā)明的熒光法并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)是可以快速且同時檢測出牛奶中單諾沙星與氟甲喹抗生素。本發(fā)明方法簡單快速、準(zhǔn)確性高、靈敏度高，可以有效解決牛奶的質(zhì)量監(jiān)控問題，使乳品安全得到保障。


圖I為校正集樣本的熒光光譜圖；圖2為PLS回歸模型中的主成分載荷圖；圖3為FLU含量PLS回歸模型的真實值與預(yù)測值間的相關(guān)關(guān)系； 圖4為DANO含量PLS回歸模型的真實值與預(yù)測值間的相關(guān)關(guān)系。
具體實施例方式一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，包括以下步驟(I)校正集樣本的收集在不含單諾沙星與氟甲喹的牛奶樣本中加入不同量的單諾沙星與氟甲喹，使牛奶體系中單諾沙星的濃度在0-56 μ g L-1范圍內(nèi)，氟甲喹的濃度在0-100 μ g Γ1范圍內(nèi)，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)，收集澄清的校正集樣本；(2)校正集樣本熒光光譜的測定使用熒光分光光度計掃描樣本，獲取熒光光譜數(shù)據(jù)；(3)校正模型的建立利用多元校正化學(xué)計量學(xué)方法，分別構(gòu)建校正集樣本中單諾沙星與氟甲喹含量與熒光光譜數(shù)據(jù)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，用于樣本單諾沙星與氟甲喹含量的預(yù)測并判斷出陰性與陽性樣品；(4)校正模型的驗證取已知單諾沙星與氟甲喹含量的牛奶驗證集樣本，在與步驟
(2)中相同條件下掃描獲取熒光光譜數(shù)據(jù)，根據(jù)已建立的校正模型計算樣本中單諾沙星與氟甲喹含量以及對陰性與陽性樣本進行分類；(5)校正模型的應(yīng)用采集待測樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)，獲取特征光譜信息，將該光譜信息輸入已建立的校正模型中，篩選出陰性樣本并計算出牛奶樣本中單諾沙星與氟甲喹的含量。所述的步驟(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)的方法為加入濃度為50% (w/V)的三氯乙酸，至蛋白質(zhì)沉淀，靜置5min,離心,過濾。所述的步驟(2)中熒光光譜數(shù)據(jù)的采集條件為以320nm為激發(fā)波長，以330-530nm為發(fā)射波長范圍，以5nm為激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度，以1200nm/min為進行光譜掃描速度，每個樣本作3次平行掃描，取平均掃描數(shù)據(jù)作為樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)。所述的多元校正化學(xué)計量學(xué)方法為偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS),使用的計算機軟件為Unscrambler軟件。所述的陰性牛奶樣本為牛奶體系中單諾沙星含量小于最大殘留量30μ gL—1、氟甲喹含量小于最大殘留量50 μ g L—1的樣本；所述的陽性樣本為牛奶體系中單諾沙星含量大于最大殘留量30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大殘留量50 μ gL—1的樣本。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明I.校正集樣本的收集(I)試劑、溶液的配制DANO, FLU工作液的配制取DANO標(biāo)準(zhǔn)品O. Olg,先用甲醇溶液(色譜純)進行溶解，再用超純水定容至100ml，獲得IOOmg Γ1的DANO儲備液，裝置于棕色試劑瓶中，儲存于4°C。將得到的IOOmg Γ1的DANO儲備液稀釋至Img L—1，從而得到DANO工作液。取FLU標(biāo)準(zhǔn)品O. Olg,先用甲醇溶液(色譜純)進行溶解,再用超純水定容至100ml,獲得IOOmg Γ1的FLU儲備液，裝置于棕色試劑瓶中，儲存于4°C。將得到的IOOmg Γ1的FLU儲備液稀釋至Img L—1，從而得到FLU工作液。 三氯乙酸試劑的配制取三氯乙酸250g，再加入500ml的去離子水，獲得50% (w/V)濃度的三氯乙酸試劑。(2)校正集樣本的配制以具有代表性的某品牌超高溫滅菌的全脂陰性牛奶樣品作為校正樣本，采用加標(biāo)法，在50ml容量瓶中加入5ml牛奶，再加入適量的DANO和FLU工作液(lmg/L)，用超純水定容，使牛奶體系中 DANO 的濃度在 0-56 μ g I/1 之間(0，16，24，32，40，48，56 μ g I/1 )，F(xiàn)LU 的濃度在O-IOOyg L—1范圍內(nèi)(0，25，40，55，70，85，100 μ g L—1)。其中，兩個分析物的濃度分別兩兩混合。每個樣品移取5ml至IOml離心管中，然后再加入lml50% (w/v)濃度的三氯乙酸，振蕩混勻，靜置5min后；離心，4000rpm, IOmin,過濾,收集上清液,得校正集樣品。2.校正樣本中單諾沙星與氟甲喹的含量單諾沙星的濃度為:0，16，24，32，40，48，56μ g Γ1 ;氟甲喹的濃度為=0,25,40,55,70,85,100 μ g L—1。3.校正集樣本光譜數(shù)據(jù)的采集以320nm為激發(fā)波長，以330_530nm為發(fā)射波長范圍，以5nm為激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度，最后以1200nm/min進行突光光譜掃描。4.校正集樣本的選擇使用計算機定制軟件(Unscrambler等)殘差分布圖的方法對樣本進行選擇,將殘差值較大的數(shù)據(jù)暫定為異常樣本，以相關(guān)系數(shù)和交叉驗證誤差均方根RMSECV作為校正模型性能優(yōu)劣判定依據(jù)，剔除影響模型性能的異常樣本，最后確定校正集樣本數(shù)，校正模型及驗證模型的評價參數(shù)(I)相關(guān)系數(shù)R2:
nZ _ Λ Si=i{Fi,,actual ~ 3^ ,predicted)■ — I — yn fZi V-
^I=IW i.-actual /!..actual/
5Yi, actual為第i樣品參考方法的測定值，F(xiàn)iiartaaI為校正集所有樣品參考方法測定值的平均值，Yipredirted為校正集預(yù)測過程中第i樣品的預(yù)測值，η為校正集的樣品數(shù)。R2值越接近1，表示校正模型的預(yù)測值與真實值越接近，(2)交叉驗證均方根誤差RMSECV
權(quán)利要求
1.一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)校正集樣本的收集在不含單諾沙星與氟甲喹的牛奶樣本中加入不同量的單諾沙星與氟甲喹，使牛奶體系中單諾沙星的濃度在0-5648 171范圍內(nèi)，氟甲喹的濃度在0-100 μ g Γ1范圍內(nèi)，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)，收集澄清的校正集樣本。
(2)校正集樣本熒光光譜的測定使用熒光分光光度計掃描樣本，獲取熒光光譜數(shù)據(jù)。
(3)校正模型的建立利用多元校正化學(xué)計量學(xué)方法，分別構(gòu)建校正集樣本中單諾沙星與氟甲喹含量與熒光光譜數(shù)據(jù)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，用于樣本單諾沙星與氟甲喹含量的預(yù)測并判斷出陰性與陽性樣品。
(4)校正模型的驗證取已知單諾沙星與氟甲喹含量的牛奶驗證集樣本，在與步驟(2)中相同條件下掃描獲取熒光光譜數(shù)據(jù)，根據(jù)已建立的校正模型計算樣本中單諾沙星與氟甲喹含量以及對陰性與陽性樣本進行分類。
(5)校正模型的應(yīng)用采集待測樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)，獲取特征光譜信息，將該光譜信息輸入已建立的校正模型中，篩選出陰性樣本并計算出牛奶樣本中單諾沙星與氟甲喹的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，所述的步驟(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白質(zhì)的方法為加入濃度為50% (w/v)的三氯乙酸，至蛋白質(zhì)沉淀，靜置5min,離心,過濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，所述的步驟(2)中熒光光譜數(shù)據(jù)的采集條件為以320nm為激發(fā)波長，以330_530nm為發(fā)射波長范圍，以5nm為激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度，以1200nm/min為進行光譜掃描速度，每個樣本作3次平行掃描，取平均掃描數(shù)據(jù)作為樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，所述的多元校正化學(xué)計量學(xué)方法為偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS)，使用的計算機軟件為Unscrambler軟件。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法，所述的陰性牛奶樣本為牛奶體系中單諾沙星含量小于最大殘留量30 yg L—1、氟甲喹含量小于最大殘留量50 μ g L—1的樣本；所述的陽性樣本為牛奶體系中單諾沙星含量大于最大殘留量.30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大殘留量50 μ g L—1的樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時測定牛奶中單諾沙星與氟甲喹的熒光方法。首先收集具有代表性的已加入單諾沙星和氟甲喹的牛奶樣本作為校正集，選擇合適的熒光掃描條件，掃描得到校正樣本集的熒光光譜圖，其次以兩種抗生素各自的濃度作為參照值，應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)技術(shù)，同時構(gòu)建牛奶中單諾沙星和氟甲喹熒光光譜信息與其各自的濃度變量之間關(guān)系的多元校正模型，最后對未知單諾沙星和氟甲喹抗生素含量的牛奶樣本進行熒光光譜掃描和得到特征光譜信息，利用已建立的定性和定量校正模型分別判斷和計算兩種抗生素的含量。本發(fā)明方法簡單快速、準(zhǔn)確性高、靈敏度高，可以有效解決牛奶的質(zhì)量監(jiān)控問題，使乳品安全得到保障。
文檔編號G01N21/64GK102879368SQ20121036358
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者劉小鳴, 陳衛(wèi), 馮仕云, 周鵬, 范大明 申請人:江南大學(xué)