專利名稱：一種基于量子點—多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分析和納米技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法。
背景技術(shù)：
蛋白水解酶(protease, proteinase)是催化多肽或蛋白質(zhì)水解的酶的統(tǒng)稱,簡稱蛋白酶。廣泛分部于動物、植物以及細(xì)菌當(dāng)中，種類繁多，在動物的消化道以及體內(nèi)各種細(xì)胞的溶酶體內(nèi)含量尤為豐富。蛋白酶對機體的新陳代謝以及生物調(diào)控起重要作用。近年來，實驗室直接或間接檢測酶的方法有較大的發(fā)展，特別是直接檢測酶活性更是實驗醫(yī)學(xué)的研究熱點。血漿酶濃度的檢測對臨床疾病的診斷，病程發(fā)展、預(yù)后以及療效 的監(jiān)測和評估等都具有較重要的意義。酶的直接檢測方法主要有發(fā)色底物法和熒光適配體法等。但發(fā)色底物法成本高、熒光適配體法底物易水解、操作復(fù)雜，故適用范圍有限。最近，Medintz提出了一種基于量子點的熒光光譜法，可實現(xiàn)凝血酶活性的檢測，為酶活性的檢測提供了一種新的思路(Medintz I. L. , Clapp A. R. , Brunei F. M. , et al. Nat. Mater. 2006, 5, 581 - 588)。毛細(xì)管電泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分離方法開發(fā)容易等優(yōu)點，由于具備如此多的優(yōu)點以及分離生物大分子的能力，CE成為近年來發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。尤其是將熒光檢測與毛細(xì)管電泳相結(jié)合，大大提高了檢測限，拓展了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用。本試驗建立的酶活性分析檢測方法，克服了已有方法存在的缺陷，可滿足大批量檢測需要，適用范圍較廣，有較高的精確性及較好的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)對酶活性檢測的不足，本發(fā)明提供一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，首先制備一種量子點一多肽復(fù)合物，多肽用熒光標(biāo)記，量子點與熒光分子之間可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶；然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，同時檢測量子點和熒光分子標(biāo)記的多肽通道的熒光強度，將量子點和熒光分子標(biāo)記的多肽熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數(shù)；其中多肽為含有待測酶識別位點的多肽，其中C端為組氨酸標(biāo)簽序列或半胱氨酸，N端是帶負(fù)電的氨基酸并用染料分子標(biāo)記。本發(fā)明方法中所述的毛細(xì)管電泳檢測中，電泳緩沖液優(yōu)選為25 mM硼酸緩沖液，PH9. 3。所述硼酸緩沖液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾。本發(fā)明中所述的染料分子為量子點、TAMRA、羅丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且滿足標(biāo)記生物分子的染料分子與量子點之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。本發(fā)明方法可用于檢測各種水解酶活性，根據(jù)不同的酶，多肽為含有相應(yīng)酶識別位點的多肽。例如檢測凝血酶時，所述的多肽為含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽。將酶與量子點一多肽復(fù)合物混合后，可根據(jù)FRET信號的變化檢測酶活性。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統(tǒng)酶活性檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合多波長熒光檢測靈敏度高等優(yōu)點，建立的一種新的高靈敏酶活性檢測技術(shù)。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，操作容易，檢測靈敏度高，可實現(xiàn)酶活性檢測；熒光光譜儀可同時檢測多個熒光波長，從而減少了誤差，提高了檢測的準(zhǔn)確性。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖I是本發(fā)明所用的量子點一多肽復(fù)合物發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移示意圖。圖2是用量子點一多肽復(fù)合物QD H6-Cy5檢測凝血酶酶活性的毛細(xì)管電泳圖。不同濃度的凝血酶(a, O μΜ; b, O. 034 MM; c, O. 068 MM; d, 0. 135 μΜ; e, 0. 27 MM; f,0.54 μΜ; g, 1.35 μΜ)與QD H6_Cy5在37 °C混合10分鐘后用毛細(xì)管電泳熒光檢測，檢測波長分別為612 nm (檢測量子點)和661 nm (檢測Cy5)。H6-Cy5:QD=32, [QD]=0. 5 μΜ.
圖3是凝血酶酶活性檢測的動力學(xué)曲線。
具體實施例方式現(xiàn)在結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法的操作流程如下
I.首先制備一種量子點一多肽復(fù)合物，多肽用熒光標(biāo)記，量子點與熒光分子之間可以產(chǎn)生FRET。將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶。2電泳緩沖液本方法中所用的電泳緩沖液為25mM硼酸緩沖液(pH9. 3)。3毛細(xì)管本方法中所用的毛細(xì)管為未涂層毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μ m,長度60 cm,有效長度35 cm)ο4電泳檢測進(jìn)樣電壓12 KV，進(jìn)樣10 S，然后停止加壓。分離電壓18 KV，分離10 min,同時檢測供體(量子點)和受體(熒光分子標(biāo)記的多肽)通道的熒光強度，收集、分析得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。5將供體和受體熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數(shù)。實施例I凝血酶活性檢測 實例中使用的儀器及操作條件如下
所用毛細(xì)管電泳為基于熒光顯微鏡自搭毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，高壓電源為上海核物理研究所生產(chǎn)；熒光光譜儀為海洋光學(xué)QE65000 ;自制顯微鏡接口，將顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)口的熒光通過光纖導(dǎo)入光譜儀。采用電壓進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓12 KV，進(jìn)樣時間為10 S，電泳電壓為18 KV，電泳10 min。
圖I為檢測凝血酶活性過程中，量子點一多肽復(fù)合物發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移示意圖。圖2為用量子點一多肽復(fù)合物QD H6_Cy5檢測凝血酶酶活性的毛細(xì)管電泳圖。設(shè)置光譜儀的檢測波長分別為612 nm (檢測QDs)和661nm (檢測Cy5)。實驗結(jié)果表明，凝血酶的濃度增加，F(xiàn)RET信號逐漸減弱，因此該方法可以用來檢測酶活性。并且可根據(jù)不同凝血酶濃度的熒光強度變化進(jìn)行曲線擬合，計算酶活性的參數(shù)(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于首先制備量子點一多肽復(fù)合物，多肽用熒光標(biāo)記，量子點與熒光分子之間可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移；將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶；然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，同時檢測量子點和熒光分子標(biāo)記的多肽通道的熒光強度，將量子點和熒光分子標(biāo)記的多肽熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數(shù)；其中多肽為含有待測酶識別位點的多肽，其中C端為組氨酸標(biāo)簽序列或半胱氨酸，N端是帶負(fù)電的氨基酸并用染料分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求I所述的基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述的毛細(xì)管電泳檢測中，電泳緩沖液為25mM硼酸緩沖液，pH9. 3。
3.如權(quán)利要求2所述的基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述硼酸緩沖液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾。
4.如權(quán)利要求I所述的基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述的酶為凝血酶；所述的多肽為含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽，其中C端為組氨酸標(biāo)簽序列或半胱氨酸，N端是帶負(fù)電的氨基酸并用染料分子標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求I所述的基于量子點一多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述染料分子為量子點、TAMRA、羅丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且滿足標(biāo)記生物分子的染料分子與量子點之間可以發(fā)生突光共振能量轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于量子點—多肽復(fù)合物的熒光毛細(xì)管電泳檢測酶活性的方法，屬于生物分析、納米技術(shù)領(lǐng)域。首先制備一種量子點—多肽復(fù)合物，多肽用熒光標(biāo)記，量子點與熒光分子之間可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。將酶與量子點—多肽復(fù)合物混合后，可根據(jù)FRET信號的變化檢測酶活性。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統(tǒng)酶活性檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合多波長熒光檢測靈敏度高等優(yōu)點，建立的一種新的高靈敏酶活性檢測技術(shù)。
文檔編號G01N21/64GK102879454SQ201210367070
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車禮 申請人:常州大學(xué)