專(zhuān)利名稱(chēng)：一種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，針對(duì)可溶性糖和淀粉的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
天然橡膠(順式多聚異戊二烯)是重要的商業(yè)、國(guó)防和交通工業(yè)原料(Ko J H etal.，2003)。目前全球所需天然橡膠的90%左右來(lái)自巴西橡膠樹(shù)。淀粉的動(dòng)員對(duì)于膠乳再 生和補(bǔ)償持續(xù)割膠傷害有不可忽略的作用。木質(zhì)部中淀粉可以看做一種長(zhǎng)效儲(chǔ)存源，而樹(shù)皮中淀粉只是作為即時(shí)的緩沖。木質(zhì)部中的可溶性糖作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)庫(kù)，樹(shù)皮中的可溶性糖可以被看做一種中間的、隨時(shí)準(zhǔn)備被使用的儲(chǔ)藏。對(duì)樹(shù)皮和木質(zhì)部中淀粉消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行研究對(duì)于我們分析不同膠樹(shù)產(chǎn)膠潛力和調(diào)整割膠強(qiáng)度有重要意義，在此條件下掌握橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部的可溶性糖和淀粉提取和測(cè)定方法是解決這項(xiàng)工作的前提。目前，人們對(duì)于樹(shù)木淀粉提取的研究較少，在我國(guó)，80年代初期梁尚樸對(duì)橡膠樹(shù)樹(shù)木的淀粉含量進(jìn)行過(guò)測(cè)定(割膠制度改革論文集一，P148-153)，由于條件限制，當(dāng)時(shí)使用割膠后的樹(shù)皮直接染色后按照顏色深淺分級(jí)，肉眼分辨淀粉的等級(jí)，該方法沒(méi)有將淀粉含量定量，也沒(méi)有測(cè)定木質(zhì)部淀粉含量。在國(guó)外，加拿大研究人員對(duì)于楊樹(shù)和松樹(shù)的葉子和根的淀粉進(jìn)行提取和測(cè)定，采用的是酶解的方法(Pak S C and Simon M L，2004)，由于該方法操作過(guò)程步驟較多，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，需要的樣品量較多，對(duì)于橡膠樹(shù)而言，樹(shù)皮是割膠的保證，盡量保護(hù)試驗(yàn)用樹(shù)也是保障后續(xù)試驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行的基礎(chǔ)，因此，所述方法并不適合于橡膠樹(shù)的樹(shù)木淀粉檢測(cè)。如何建立橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物提取及含量測(cè)定方法，成為本領(lǐng)域需要解決的技術(shù)問(wèn)題，目前，關(guān)于這方面的技術(shù)成果，并未見(jiàn)諸報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，鑒于目前本領(lǐng)域?qū)τ诜治霾煌z樹(shù)產(chǎn)膠潛力和調(diào)整割膠時(shí)間和強(qiáng)度沒(méi)有一種較為理想的檢測(cè)方法，提供一種利用橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物提取及含量測(cè)定方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在于分別建立可溶性糖626nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和淀粉580nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；從橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部中取樣后，分別提取樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容ΙΟΟμΙ可溶性糖提取液加入3ml蒽酮試劑，90°C保溫15min，冷卻至室溫后在626nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μ1Ι2_ΚΙ溶液，在580nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的淀粉含量。在本發(fā)明的技術(shù)方案中
可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是這樣建立的首先確定用硫酸-蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量的最高光吸收峰用80%乙醇溶液分別配制濃度為lmg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，將它們分別按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1體積比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮試劑，90°C保溫15min,冷卻至室溫后在300nm-900nm范圍內(nèi)掃描光吸收,確定可溶性糖混合液掃描最高吸收峰為626nm處；
再利用硫酸-蒽酮法測(cè)定不同濃度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，選取的可溶性糖濃度分別為OKg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml、400Pg/ml、600Pg/ml、800Pg/ml、lOOOPg/ml，取ΙΟΟμΙ加入3ml硫酸-蒽酮試劑，90°C保溫15min，冷卻至室溫后626nm處測(cè)定光吸收；以光吸收測(cè)定值為橫坐標(biāo)，可溶性糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
硫酸-蒽酮試劑是用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸配制成的,其中，IOOml稀硫酸采用70ml濃硫酸與30ml水混合；
淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是這樣建立的
首先配制以下溶液80%Ca (NO3) 2溶液的配制80gCa (NO3) 2· 2Η20溶于水中，定容至100ml ；I2-KI溶液的配制1. 3gl2加上3. 5gKI，溶解后容量瓶定容至IOOml ;用lmg/ml淀粉母液按比例用 80%Ca (NO3) 2 溶液分別稀釋成 5(^g/ml、100μδ/πι1、200μδ/πι1、300μδ/πι1、400μδ/πι1淀粉溶液；
取不同濃度淀粉母液2ml，加入ΙΟΟμΙI2-KI溶液，在580nm處測(cè)定光吸收，以光吸收測(cè)定值為橫坐標(biāo)，淀粉溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在本發(fā)明的技術(shù)方案中樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是這樣獲得的
a)用直徑0.5cm小型打孔器，直接用手將打孔器戳進(jìn)樹(shù)皮內(nèi)，從樹(shù)皮中取出相應(yīng)樹(shù)皮，作為樹(shù)皮樣品；再在樹(shù)皮取樣口用小型電鉆在木質(zhì)部打孔部位鉆孔取出木屑，作為木質(zhì)部樣品，鉆孔深度為3. 0cm，取樣后用大小合適的鐵釘堵住樹(shù)皮和木質(zhì)部取樣口 ；
b)分別對(duì)樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品液氮研磨，磨碎后烘箱40°C過(guò)夜烘干，取10-200mg，在
0.5ml-4ml的80%乙醇80°C浸提40min，中間斡旋攪拌，12000rpmX IOmin離心，收集上清，殘?jiān)?0%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10mg，80°C脫色30min，離心后取清液定容至10ml，分別獲得樹(shù)皮和木質(zhì)部的可溶性糖提取液；
c)將提取可溶性糖后的樹(shù)皮和木質(zhì)部沉淀殘?jiān)謩e用2ml80%Ca(NO3)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm離心5min，收集上清，殘?jiān)?ml80%Ca (NO3) 2沖洗一次，離心收集上清，合并提取液，分別獲得樹(shù)皮和木質(zhì)部淀粉提取液。在本發(fā)明的技術(shù)方案中
可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的曲線(xiàn)方程為Y=427. 00Χ，R2=O. 9942 ；
樣品中可溶性糖含量的計(jì)算公式為
樣品中可溶性糖含量=427. 00ΧΑΧ定容體積/樣品質(zhì)量；
式中Α為測(cè)得的光吸收，427. 00ΧΑ計(jì)算為與光吸收對(duì)應(yīng)的糖濃度；可溶性糖含量的單位為Mg/mg,糖濃度的單位為Pg/ml,定容體積的單位為ml,樣品質(zhì)量的單位為mg ；
淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的曲線(xiàn)方程為y=177. 84x, r2=0. 993 ；
樣品中淀粉的計(jì)算公式為
樣品中淀粉含量(Kg/mg) =177. 84XAX定容體積/樣品質(zhì)量；式中A為測(cè)得的光吸收，177. 84XA計(jì)算為與光吸收對(duì)應(yīng)的淀粉濃度；淀粉含量的單位為Mg/mg,淀粉濃度的單位為Kg/ml,定容體積的單位為ml,樣品質(zhì)量的單位為mg。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明只需要取少量樹(shù)皮和木質(zhì)部(最低取樣量為IOmg)就能進(jìn)行可溶性糖和淀粉含量測(cè)定，對(duì)橡膠樹(shù)的樹(shù)皮和木質(zhì)部傷害較小，而橡膠樹(shù)的樹(shù)皮是橡膠樹(shù)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的保證，節(jié)約橡膠樹(shù)的樹(shù)皮消耗量可以延長(zhǎng)割膠時(shí)間，提高橡膠樹(shù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值；木質(zhì)部中淀粉可以看做是一種長(zhǎng)效儲(chǔ)存源，而樹(shù)皮中淀粉只是作為即時(shí)的緩沖，木質(zhì)部中的可溶性糖作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)庫(kù)，樹(shù)皮中的可溶性糖可以被看做一種中間的、隨時(shí)準(zhǔn)備被使用的儲(chǔ)藏，通過(guò)本發(fā)明能夠快速獲得樹(shù)皮和木質(zhì)部中蔗糖和淀粉的含量，為每年開(kāi)割初期準(zhǔn)確確定橡膠樹(shù)開(kāi)割時(shí)間、制定不同無(wú)性系橡膠樹(shù)在植膠區(qū)不同物候下的含量標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)橡膠樹(shù)割膠潛力提供技術(shù)支持，它與淀粉酶解法相比，不僅步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，而且對(duì)橡膠樹(shù)傷害小，實(shí)際應(yīng)用時(shí)具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。


圖I是可溶性糖在626nm處測(cè)定光吸收的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖2是淀粉在580nm處測(cè)定光吸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖3是無(wú)性系PR107的樹(shù)皮和木質(zhì)部不同高度處測(cè)定的可溶性糖及淀粉在樹(shù)干結(jié)果，其中a為樹(shù)皮中可溶性糖含量曲線(xiàn)，b為樹(shù)皮中淀粉含量曲線(xiàn)；c為木質(zhì)部中可溶性糖含量曲線(xiàn)，d為木質(zhì)部中淀粉含量曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
建立可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
用80%乙醇溶液分別配制濃度為lmg/ml的葡萄糖(還原性糖)和蔗糖(非還原性糖)溶液；將它們分別按照1: 4、3: 7、I: I、7:3和4:1體積比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸(70ml濃硫酸加30ml水)配制成蒽酮試劑。鹿糖與葡萄糖溶液按比例混合(混合比例如下表)，混合液ΙΟΟμΙ加入3ml蒽酮試劑，90°C保溫15min，掃描光吸收最大值
表I可溶性糖光吸收峰測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在于分別建立可溶性糖626nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和淀粉580nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；從橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部中取樣后，分別提取樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容ΙΟΟμΙ可溶性糖提取液加入3ml蒽酮試劑，90°C保溫15min，冷卻至室溫后在626nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μ1Ι2_ΚΙ溶液，在580nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的淀粉含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的橡膠樹(shù)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在于 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是這樣建立的 首先確定用硫酸-蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量的最高光吸收峰用80%こ醇溶液分別配制濃度為lmg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，將它們分別按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1體積比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮試劑，90°C保溫15min,冷卻至室溫后在300nm-900nm范圍內(nèi)掃描光吸收,確定可溶性糖混合液掃描最高吸收峰為626nm處； 再利用硫酸-蒽酮法測(cè)定不同濃度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，選取的可溶性糖濃度分別為0Pg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml、400Pg/ml、600Pg/ml、800Pg/ml、lOOOPg/ml，取ΙΟΟμΙ加入3ml硫酸-蒽酮試劑，90°C保溫15min，冷卻至室溫后626nm處測(cè)定光吸收；以光吸收測(cè)定值為橫坐標(biāo)，可溶性糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； 硫酸-蒽酮試劑是用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸配制成的,其中，IOOml稀硫酸采用70ml濃硫酸與30ml水混合； 淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是這樣建立的 首先配制以下溶液80%Ca (NO3) 2溶液的配制80gCa (NO3) 2· 2Η20溶于水中，定容至100ml ；I2-KI溶液的配制1. 3gl2加上3. 5gKI，溶解后容量瓶定容至IOOml ;用lmg/ml淀粉母液按比例用 80%Ca(NO3)2 溶液分別稀釋成 5(^g/ml、100μδ/πι1、200μδ/πι1、300μδ/πι1、400μδ/πι1淀粉溶液； 取不同濃度淀粉母液2ml，加入ΙΟΟμΙI2-KI溶液，在580nm處測(cè)定光吸收，以光吸收測(cè)定值為橫坐標(biāo)，淀粉溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在于 樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是這樣獲得的 a)用直徑0.5cm小型打孔器，直接用手將打孔器戳進(jìn)樹(shù)皮內(nèi)，從樹(shù)皮中取出相應(yīng)樹(shù)皮，作為樹(shù)皮樣品；再在樹(shù)皮取樣ロ用小型電鉆在木質(zhì)部打孔部位鉆孔取出木屑，作為木質(zhì)部樣品，鉆孔深度為3. 0cm，取樣后用大小合適的鐵釘堵住樹(shù)皮和木質(zhì)部取樣ロ ； b)分別對(duì)樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品液氮研磨，磨碎后烘箱40°C過(guò)夜烘干，取10-200mg，在0.5ml-4ml的80%こ醇80°C浸提40min，中間斡旋攪拌，12000rpmX IOmin離心，收集上清，殘?jiān)?0%こ醇重提一次，合井上清，上清中加入活性炭10mg，80°C脫色30min，離心后取清液定容至10ml，分別獲得樹(shù)皮和木質(zhì)部的可溶性糖提取液； c)將提取可溶性糖后的樹(shù)皮和木質(zhì)部沉淀殘?jiān)謩e用2ml80%Ca(N03)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm離心5min，收集上清，殘?jiān)?ml80%Ca (NO3) 2沖洗一次，離心收集上清，合并提取液，分別獲得樹(shù)皮和木質(zhì)部淀粉提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3之一所述的橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在干 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的曲線(xiàn)方程為Y=427. OOX，R2=O. 9942 ； 樣品中可溶性糖含量的計(jì)算公式為 樣品中可溶性糖含量=427. OOXAX定容體積/樣品質(zhì)量； 式中Α為測(cè)得的光吸收，427. OOXA計(jì)算為與光吸收對(duì)應(yīng)的糖濃度；可溶性糖含量的單位為Mg/mg,糖濃度的單位為Pg/ml,定容體積的單位為ml,樣品質(zhì)量的單位為mg ；淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的曲線(xiàn)方程為·y=177. 84x, r2=0. 993 ； 樣品中淀粉的計(jì)算公式為 樣品中淀粉含量(Kg/mg) =177. 84XAX定容體積/樣品質(zhì)量； 式中A為測(cè)得的光吸收，177. 84XA計(jì)算為與光吸收對(duì)應(yīng)的淀粉濃度；淀粉含量的單位為Mg/mg,淀粉濃度的單位為Kg/ml,定容體積的單位為ml,樣品質(zhì)量的單位為mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定方法，其特征在于分別建立可溶性糖626nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和淀粉580nm處光吸收量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；從橡膠樹(shù)樹(shù)皮和木質(zhì)部中取樣后，分別提取樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；取100μl可溶性糖提取液加入3ml蒽酮試劑，90℃保溫15min，冷卻至室溫后在626nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μlI2-KI溶液，在580nm處測(cè)定光吸收量，對(duì)照淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別計(jì)算樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品的淀粉含量。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102854162SQ20121036825
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者魏芳, 校現(xiàn)周, 羅世巧, 吳明, 仇鍵, 楊文鳳, 鄭乾坤 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所