專利名稱：一種人腫瘤標(biāo)志物糖類抗原50(ca50)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及檢測血清中腫瘤標(biāo)志物CA50含量的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其測試方法
背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物(tumor mark, TM)是指腫瘤細(xì)胞分泌或脫落到體液或組織中的物質(zhì)，或是宿主對體內(nèi)寄生物反應(yīng)而產(chǎn)生并進(jìn)入到體液或組織中的物質(zhì)。目前臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物大多是非特異性標(biāo)志物，這些標(biāo)志物在良性腫瘤和正常組織中也有出現(xiàn)，但在腫瘤 發(fā)生時，其水平明顯提高。由于這類標(biāo)志物沒有腫瘤特異性，因此又稱為廣譜性腫瘤標(biāo)志物。CA50是由Lindbolm等(1983)發(fā)現(xiàn)的一種非特異性廣譜腫瘤標(biāo)志物，其在消化道腫瘤和其它系統(tǒng)腫瘤中均有很好的應(yīng)用價(jià)值。CA50是一種以唾液酸脂和唾液酸糖蛋白為主要成分的糖類抗原，廣泛存在于胰腺、膽囊、肝、胃、結(jié)直腸、膀胱、子宮，正常組織中一般不存在。當(dāng)細(xì)胞惡變時，糖基轉(zhuǎn)化酶的失活或胚胎期才活躍的某些轉(zhuǎn)化酶又被激活，造成細(xì)胞表面糖基結(jié)構(gòu)改變從而形成CA50。經(jīng)研究證實(shí)在多種惡性腫瘤患者血中CA50皆有升高，對胰腺癌和膽囊癌的陽性檢出率居首位(90%以上)，其次為卵巢或子宮頸癌、肝癌、結(jié)腸/直腸癌、膀臟癌、胃癌、肺癌。因此，CA50在臨床上主要用于對胰腺癌、膽囊癌、肝癌、胃癌及卵巢癌等腫瘤診斷有較高價(jià)值，此外還可作為評價(jià)腫瘤術(shù)后手術(shù)效果的指標(biāo)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)于上個世紀(jì)80年代，繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，相對于后兩者化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具有高靈敏度、高特異性，操作簡便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，同時無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，因此近年來在臨床檢測分析中被廣泛推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種糖類抗原50 (CA50)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進(jìn)行CA50檢測具有較高的靈敏度和特異性，操作更簡便，檢測時間更短。本發(fā)明提供了檢測CA50化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；CA50校準(zhǔn)品；CA50質(zhì)控品；CA50抗試劑；清洗濃縮液；發(fā)光底物溶液；樣本稀釋液。所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液；
所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品為含有一定量CA50抗原的BSA緩沖液；
所述的抗試劑是由堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的CA50單克隆抗體及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CA50單克隆抗體的混合液；
所述的清洗濃縮液是含有Tris、NaCl和表面活性劑等的緩沖液；所述的發(fā)光底物溶液是含Lumigen APS-5發(fā)光液的緩沖液；
所述的樣本稀釋液是含有BSA的溶液。本發(fā)明所提供的檢測CA50的樣品前處理方法，包括以下步驟
I、樣品前處理
對臨床血清，3000rpm離心5分鐘，取上層液即可進(jìn)行分析測定。待測樣品2_8°C存放不得超過48小時，若48小時未檢測，應(yīng)于_20°C以下保存，但不應(yīng)超過30天。2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)前需將所有試劑放置至室溫；準(zhǔn)備好一次性平底試管和磁分離器及溫育時用于覆蓋磁分離器的塑料膜；調(diào)節(jié)水浴箱溫度為37°C;準(zhǔn)備化學(xué)發(fā)光測定儀，并仔細(xì)閱讀儀器使用說明書。 3、試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)前將試劑盒中各試劑置混勻儀上充分混勻；磁微粒試劑混勻后應(yīng)為均勻懸濁液，無明顯凝集。4、利用上述檢測CA50的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒檢測樣品。本發(fā)明的檢測方法如下
(1)加樣與免疫反應(yīng)在每一平底試管中加入30μ I CA50校準(zhǔn)品(質(zhì)控品或待測樣本)；60 μ I抗試劑，混勻后，37°C溫育30分鐘；加入30 μ I磁微粒試劑，混勻后，37°C溫育5分鐘；
(2)洗滌將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；重復(fù)兩次；
(3)加入發(fā)光底物溶液每個試管加入200μ I發(fā)光底物；
(4)讀取發(fā)光值用化學(xué)發(fā)光儀測定每管的發(fā)光值；
(5)如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現(xiàn)高值HOOK效應(yīng)，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余指標(biāo)選擇合適的稀釋倍數(shù)對樣品進(jìn)行稀釋。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、使用磁珠為固相，使免疫反應(yīng)更接近液相，反應(yīng)更充分和迅速，而且使結(jié)合的免疫復(fù)合物更加容易分離，降低了非特異性吸附。2、使用的抗試劑為單克隆抗體混合物，使免疫反應(yīng)的親和力更高，而且單抗的生產(chǎn)批間差異相對小，更容易保證產(chǎn)品的批間穩(wěn)定。3、使用化學(xué)發(fā)光底物溶液，使檢測的靈敏度得到了提高，而且線性范圍更寬。4、本方法的建立可以為其他試劑盒的開發(fā)提供一種方便、高靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的免疫檢測方法。本發(fā)明的主要創(chuàng)新之處在于
I、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。2、試劑盒中的磁微粒試劑、抗試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、發(fā)光底物溶液及樣本稀釋液是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。本發(fā)明的檢測CA50的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒主要采用直接夾心法定量檢測人血清等樣品中CA50的含量；對樣品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品；采用了高特異的單克隆抗體和超順磁、高分散、比表面積大的磁微粒子，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利，與市場上的酶聯(lián)免疫試劑盒等相比，線性范圍寬，有效避免鉤狀效應(yīng)，不需樣品稀釋，適用于大批量樣品篩選的定量。


圖I為本發(fā)明的CA50化學(xué)發(fā)光免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，橫坐標(biāo)為CA50的濃度， 縱坐標(biāo)為相對發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程以配制IL為例
1、根據(jù)配制量，選擇合適容器，加入700ml的純水；
2、稱取Tris6. 02g, NaN3 O. 99g于容器中，混勻，室溫?cái)嚢?小時；
3、檢測溶液？!1，應(yīng)在10左右；
4、調(diào)制pH值為8.0；
5、量取Tween-202.76ml ;稱取硫酸新霉素O. 99g;四環(huán)素O. 03g ;BSA 4. 97g于容器中，攪拌I小時，調(diào)pH值至8. 0±0. 05;
6、定容至1L，調(diào)pH值至8.0±0. 05 ;
7、用O.22um濾器過濾，貯存于4°C。二、磁微粒試劑的制備過程
將直徑為O. I微米的四氧化三鐵微球用戊二醛進(jìn)行活化，室溫混勻4小時后，用O. 01mol/L PBS pH7. 4緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50-100mg/ml ;然后，每毫升懸液中加入羊抗FITC抗體100 μ g，于37°C混勻溫育3-8小時；用等體積的O. Olmol/L PBS 5%BSA ρΗ7· 4 緩沖液于 37°C封閉 40 分鐘；最后，用 O. 5%BSA O. 02mol/L Tris-HClpH8. O緩沖液清洗三次，并用上述磁珠緩沖液配制一定濃度的工作液。實(shí)施例2
一、堿性磷酸酶AP與抗CA50單克隆抗體的偶聯(lián)
抗體為免疫球蛋白，含有氨基(-NH2),使用SMCC活化劑進(jìn)行活化，生成馬來酰亞胺-免疫球蛋白；馬來酰亞胺-免疫球蛋白含有可以與-SH基團(tuán)反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)，加入含有-SH的堿性磷酸酶，可以將抗體與堿性磷酸酶連接在一起。二、異硫氰酸熒光素FITC與抗CA50單克隆抗體的偶聯(lián)
FITC分子與CA50單克隆抗體的偶聯(lián)物是以常見的堿性液標(biāo)記法對抗體進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時，蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物,即突光抗體或突光結(jié)合物。一般最多能結(jié)合15-20個,一個IgG分子可結(jié)合2-8個分子的FITC，其反應(yīng)式如下FITC-N=C=S + -NH9-蛋白質(zhì) —FITC-NS-C-NHo-蛋白質(zhì)實(shí)施例3
校準(zhǔn)品/質(zhì)控品的配制
1、最高點(diǎn)最高濃度點(diǎn)為X，目標(biāo)點(diǎn)濃度為A，B，C，D，E，F(xiàn)，配制V體積溶液時，需加入原料的體積分別為表I
權(quán)利要求
1.一種人腫瘤標(biāo)志物糖類抗原50即CA50的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于將羊抗FITC抗體與直徑為O. 1-5微米的磁微粒連接組成固相試劑，經(jīng)捕捉反應(yīng)體系中的FITC標(biāo)記抗體、抗原以及酶標(biāo)記抗體后形成固相-FITC標(biāo)記抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體夾心復(fù)合物；所述的酶標(biāo)記抗體中使用的酶是堿性磷酸酶AP ;所述的酶標(biāo)試劑的偶聯(lián)方法是將N-琥珀酰胺3- (2-吡啶二巰基)丙酸SPDP活化的抗體與Traunt ’ s試劑活化的堿性磷酸酶以1:0. 5-2的比例混合，并用凝膠層析柱分離純化；所使用的底物溶液為環(huán)二氧乙烷類衍生物AMPPD。
2.如權(quán)利要求I所述的CA50磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；CA50校準(zhǔn)品；CA50質(zhì)控品；CA50抗試劑；清洗濃縮液；發(fā)光底物溶液；樣本稀釋液； 所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液； 所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品為含有一定量CA50抗原的BSA緩沖液； 所述的抗試劑是由堿性磷酸酶AP標(biāo)記的CA50單克隆抗體及異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記的CA50單克隆抗體的混合液； 所述的清洗濃縮液是含有Tris、NaCl和表面活性劑等的緩沖液； 所述的發(fā)光底物溶液是含Lumigen APS-5發(fā)光液的緩沖液； 所述的樣本稀釋液是含有BSA的溶液。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下 (1)加樣與免疫反應(yīng)在每一平底試管中加入30μ I CA50校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或待測樣本；60 μ I抗試劑，混勻后，37°C溫育30分鐘；加入30 μ I磁微粒試劑，混勻后，37°C溫育5分鐘； (2)洗滌將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；重復(fù)兩次； (3)加入發(fā)光底物溶液每個試管加入200μ I發(fā)光底物； (4)讀取發(fā)光值用化學(xué)發(fā)光儀測定每管的發(fā)光值。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于,所述待測樣本為高值HOOK樣本時，根據(jù)需要使用樣本稀釋液對樣本進(jìn)行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤標(biāo)志物糖類抗原50(CA50)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測方法，屬于免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CA50單克隆抗體和堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的單克隆抗體與抗原結(jié)合，形成FITC標(biāo)記抗體-抗原-AP標(biāo)記抗體的夾心免疫復(fù)合物，類似“三明治”結(jié)構(gòu)。隨后加入連有抗FITC抗體的磁性微粒，通過抗FITC抗體與FITC的特異性結(jié)合使抗原抗體復(fù)合物連接在磁顆粒上，在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光與磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的靈敏度、線性范圍寬、快速等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且大大降低了產(chǎn)品成本，在臨床檢驗(yàn)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK102901820SQ20121037203
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者汪丹, 丁建華 申請人:江陰澤成生物技術(shù)有限公司