專利名稱：一種一步法乙肝病毒PreS1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種一步法乙肝病毒前SI (PreSl)抗原(Ag)酶聯(lián)免疫測定試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
我國屬于乙型肝炎病毒高發(fā)區(qū)，乙型肝炎已經(jīng)成為危害我國人民身體健康的社會公眾性問題，乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物(HBVM)作為乙型肝炎病毒診斷的常規(guī)項(xiàng)目已不能滿足臨床，HBV-DNA、病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒前SI (PreSlAg)抗原都作為HBV在人體內(nèi)感染和復(fù)制的證據(jù)。HBV為嗜肝DNA病毒，由一個不完全雙鏈DNA組成，約3200個氨基酸，有4個開放讀碼框?yàn)镾區(qū)、C區(qū)、P區(qū)、X區(qū)。S基因區(qū)又可分成三段，從上游開始依次為前SI (preSl)區(qū)、前S2(preS2)區(qū)和S區(qū)。PreSl原具有較強(qiáng)的免疫原性，是由108或119個氨基酸組成。HBV以前SI區(qū)氨基酸21-47片段作為結(jié)合部位結(jié)合肝細(xì)胞，只要這一片段完好就有傳染性和高度的免疫源性。PreSl抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎病毒感染的最早期，比HbeAg出現(xiàn)早，是早期傳染性的標(biāo)志。乙型肝炎病毒的大量復(fù)制，導(dǎo)致大量的PreSlAg表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致大量肝細(xì)胞損傷，并認(rèn)為PreSl作為HBV的外殼蛋白成份，在HBV感染宿主細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵的作用，最重要的介導(dǎo)部位是前SI蛋白的氨基(AA)21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。PreSl在病毒感染機(jī)體的整個周期中，PreSl的獨(dú)特作用，使其能夠較充分的反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)陰過程，如急性肝炎時PreSlAg陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，反之，PreSlAg持續(xù)陽性，急性肝炎將發(fā)展至慢性肝炎。因此，PreSlAg與HBV-DNA在反映乙肝病毒復(fù)制有良好的一致性。PreSlAg較HBeAg更敏感地反映HBV復(fù)制的情況。但是目前普遍使用雙抗體夾心法檢測乙肝病毒PreSl抗原，具有很好的特異性，但是單純利用無力吸附吧單克隆抗體或者多克隆抗體吸附在酶標(biāo)板上會存在單抗使用量大，活性損失大，特別是批間精密度差等缺點(diǎn)，而將親和素包被在板上，再加入生物素化的抗體，則可以很好的解決這一問題，其不但可以減少批間差，而且可以在檢測過程中可一步直接加入樣品血清和酶標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)，形成固相親和素-生物素話抗體-乙肝病毒PreSl抗原-酶標(biāo)抗PreSl抗原抗體復(fù)合物，然后加入底物緩沖液甲和乙進(jìn)行反應(yīng)，就可以定量分析血清中的乙肝病毒PreSl抗原的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于解決傳統(tǒng)酶標(biāo)板批間差不足的問題，設(shè)計并建立了一步法PreSl抗原的檢測試劑盒。本發(fā)明提供了一種“一步法PreSl抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”，該試劑盒是包括主要成分親和素預(yù)先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS抗體的酶標(biāo)板包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記前SI抗體、陽性對照液一支、陰性對照液一支、20倍濃洗滌液I瓶、底物緩沖液甲I瓶、底物緩沖液乙I瓶及終止液(2N H2S04) I瓶組成。1、抗體制備(I)利用HBV-DNA重組PreSl Ag基因片段通過原核表達(dá)或者真核表達(dá)制備抗原；(2)制備抗體的制備和純化用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤；細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。(3)用親和素先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗乙肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS進(jìn)行二次包被反應(yīng),制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔；(4)辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗乙肝病毒PreSl抗體酶聯(lián)，制成酶標(biāo)抗體；(5)配制陽性對照液、陰性對照液；(6)配制20倍濃縮洗液；(7)配制底物緩沖液甲；(8)配制底物緩沖液乙；(9)配制終止液(2N H2S04)。(10)分裝上述試劑盒除預(yù)報被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中；(11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性合格；(12)組裝成成品。2、本發(fā)明的試劑盒在使用時可以如下操作(I)取出已包被條孔或板，恢復(fù)至室溫。(2)配液將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液lml+19ml蒸餾水即為工作液)。(3)加樣每孔加待檢血清50ul，各板設(shè)陽性對照一孔(50ul)，陰性對照一孔(50ul)，空白對照一孔(加蒸餾水50ul)，然后除空白對照孔外，各孔加酶標(biāo)記液50ul，(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。(5)洗滌小心揭掉封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。(6)每孔加入顯色液A、B各I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘(7)測定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶免分析儀波長于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測)，測定各孔OD值。(8)結(jié)果判定陰性對照(A值)*2. 5 =臨界值(cut off值)，陰性對照高于O. 05時按實(shí)際OD值算，陰性對照小于O. 05按O. 05計算，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽性。本發(fā)明的試劑盒能非常專一地檢測患者血清中HBsAg-PreSl蛋白的濃度。它具有簡便、靈敏和穩(wěn)定等特點(diǎn)。且本試劑盒操作簡便快速，采用一步法可在30分鐘左右獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比PCR檢測法省時(PCR法最快需要6-8小時完成實(shí)驗(yàn))，經(jīng)臨床試用PreSl蛋白檢測陽性與PCR檢測的HBV-DNA陽性有很好的符合率，本試劑盒和PCR法相比，PCR需貴重的儀器設(shè)備，消耗性試劑昂貴，收費(fèi)價又高，而本試劑盒整個實(shí)驗(yàn)中無需貴重儀器設(shè)備，消耗性試劑便宜且收費(fèi)價低廉，能適用于各級醫(yī)院及臨床測試中心，也可用于流行病學(xué)普查。一步法PreSl Ag試劑盒，具有簡便、靈敏、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，能檢出完整HBV，將可被普遍使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、制備一步法乙肝病毒前SI蛋白酶免試劑盒的生產(chǎn)步驟1、生物素化抗體制備(I)純化包被抗體(HBsAb):用重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。效價大于10萬。(2)生物素偶聯(lián)抗PreSl抗體用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N_二甲基酰胺(DMF)配成lmg/Ml，用O.1mol/L pH值為9. O的NaHC03將純化的抗PreSl抗體稀釋成l_2mg/mL，按BNHS與抗體的容積比為1: 8或重量比為1: 7左右混合，室溫攪拌下反應(yīng)2-4h，裝入透析對O. 05mol/LpH值為7. 2的PBS，4°C透析過夜，結(jié)合物加等體積的甘油，小量分裝，_20°C —下保存?zhèn)溆谩?、酶標(biāo)記抗體制備(I)抗體制備基因重組的PreSl Ag免疫豚鼠得抗PreSl抗體或重組的PreSl Ag免疫Balb/C小鼠得腹水，抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。效價大于10萬。(2)酶標(biāo)記抗體制備抗PreSl抗體用過碘酸鈉法與辣根過氧化物偶聯(lián)(3)酶標(biāo)記抗體濃度選定采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體的工作濃度大于1: 2000。PreSl重組抗原從10ug/ml倍增稀釋，包被酶標(biāo)板，加梯度稀釋的酶標(biāo)抗體測定，以確定最適稀釋度。3、預(yù)包被抗體板的制備(I)包被用O. 05M的pH值為4. 5-5. O的檸檬酸緩沖液配制所需濃度的親和素包被液，將包被液加入固相載體酶標(biāo)上，置濕盒中加蓋，40C過夜甩干。(2)洗滌用生理鹽水洗滌三遍，以去除剩余親和素。(3)封閉Na2HP04.12H202.6g·
NaH2P04. 12H200. 4g
20%Tween-202. 5mL
NaCl8.2g
BSAIOg Proclin300 ImL
重蒸水定容至lOOOmL調(diào)整PH至7. 2，將封閉液300 μ L加入微孔板各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)三次，甩掉封閉液，拍干。(4) 二次反應(yīng)包被將生物素化的抗PreSl抗體用O. 02Μ的PBS稀釋至合適濃度，加110 μ L于微孔板各孔中，置濕盒中加蓋，40C過夜甩干。用O. 02Μ的PBS溶液洗滌三遍并抽濕干燥，放入有干燥劑鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?、陽性對照的制備HBeAg和HBV-DNA同時呈陽性的乙肝患者血清。600C放置I個小時，除菌過濾，用本藥盒測定A值> O. 3，備用，分裝。5、陰性對照的制備用本試劑盒測定正常人血清A值在0-0. 03，加萬分之二硫柳汞，分裝備用。6、酶標(biāo)單抗配置用含10%小牛血清和90% O. 15MPBS稀釋Ant1-presl-HRP，稀釋20倍，分裝。7、酶標(biāo)單抗稀釋液
BSAO.5gNa2HP04. 12H202.6g
NaH2P04. 2H20O. 4g
NaCl8.2g
20%Tween-20100ml
Proclin300ImL
調(diào)整pH至7. 28、底物液A
Na2HP04. 12H201. 7g
檸檬酸.H200. 5g
3%H202200 μ I
重蒸水100ml
調(diào)整pH至5. 0
9、底物液BNa2HP04. 12H201. 7g檸檬酸·H200. 5g重蒸水100ml調(diào)整pH 至 5· O 后，加入 IOmlDMSO 含 60mgTMB 的溶液 25 μ I10、終止液濃H2S04IOml重蒸水80ml11、20X 洗滌液
Na2HP04.12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
Tween-202.5 μ I
重蒸水50ml
調(diào)整 pH至7. 212、半成品及成品的組成上述(一)一(十一)步驟所得產(chǎn)品裝入小瓶及尖底離心管中，即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、穩(wěn)定性、靈敏度及精密度檢定合格才能組裝成presl試劑盒。組裝成盒后還需抽出三份同半成品一樣經(jīng)過檢定合格才能出售。實(shí)施例2一步法乙肝病毒前SI蛋白酶免試劑盒的操作步驟1、操作步驟如下(I)取出已包被條孔或板，恢復(fù)至室溫。(2)配液將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液lml+19ml蒸餾水即為工作液)。(3)加樣每孔加待檢血清50ul，各板設(shè)陽性對照一孔(50ul)，陰性對照一孔(50ul)，空白對照一孔(加蒸餾水50ul)，然后除空白對照孔外，各孔加酶標(biāo)記液50ul。(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。(5)洗滌小心揭掉封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。(6)每孔加入顯色液A、B各I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘(7)測定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶免分析儀波長于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測)，測定各孔OD值。(8)結(jié)果判定陰性對照(A值)*2. 5 =臨界值(cut off值)，陰性對照高于O. 05時按實(shí)際OD值算，陰性對照小于O. 05按O. 05計算，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽性。
權(quán)利要求
1.ー種“一歩法こ肝病毒PreSl抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”，其特征在于該試劑盒包括 (1)用親和素先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的前SI單克隆抗體或抗HBS進(jìn)行二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔； (2)酶標(biāo)記前SI抗體； (3)陽性對照液I支、陰性對照液I支； (4)20倍濃縮洗液I瓶； (5)底物緩沖液甲I瓶； (6)底物緩沖液こI瓶； (7)終止液(4NH2S04) I瓶組成。
2.—種如權(quán)利I所描述的ー種“ー步法こ肝病毒PreSl抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟 (1)利用HBV-DNA重組PreSlAg基因片段通過原核表達(dá)或者真核表達(dá)制備抗原； (2)制備抗體的制備和純化用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上，效價大于10萬。
(3)用親和素先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗こ肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS進(jìn)行二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔； (4)辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗こ肝病毒PreSl抗體酶聯(lián)，制成酶標(biāo)抗體； (5)配制陽性對照液、陰性對照液； (6)配制20倍濃縮洗液； (7)配制底物緩沖液甲； (8)配制底物緩沖液こ； (9)配制終止液(2NH2S04)。
(10)分裝上述試劑盒除預(yù)報被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中； (11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性合格； (12)組裝成成品。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的一種“一歩法こ肝病毒PreSl抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”，其特征在于其中所述的抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔、酶標(biāo)記前抗體、陽性對照液為HBV-DNA和HBeAg均陽性血清，陰性對照液為正常人血清、濃洗滌液為磷酸-Tween-20緩沖液，底物緩沖液甲為H202、底物緩沖液乙為3. 3’，5. 5’ -四甲基聯(lián)苯胺和終止液為(4N H2S04)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述親和素包被固相載體酶標(biāo)板采用一下方法用0. 05M的pH值為4. 5-5. 0的檸檬酸緩沖液配制所需濃度的親和素包被液，將包被液加入固相載體酶標(biāo)上，并洗滌、封閉，再加入生物素化的こ肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS抗體進(jìn)行反應(yīng)后，經(jīng)洗滌、抽濕干燥后用鋁箔袋密封。
5.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液配方為含0.02MPBS,8.9%NaCl 和 0. 5% Tween-20 o
全文摘要
本發(fā)明提供了一種“一步法PreS1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”，能非常專一地檢測患者血清中HBsAg-PreS1蛋白的濃度。該試劑盒是包括主要成分親和素預(yù)先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreS1單克隆抗體或抗HBS抗體的酶標(biāo)板包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記前S1抗體、陽性對照液一支、陰性對照液一支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶及終止液(2NH2SO4)1瓶組成。本發(fā)明具有較好的均一性，特異性，靈敏度，采快速簡便，用一步法可在30分鐘左右獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比PCR檢測法省時(PCR法最快需要6-8小時完成實(shí)驗(yàn))，經(jīng)臨床試用PreS1蛋白檢測陽性與PCR檢測的HBV-DNA陽性有很好的符合率。
文檔編號G01N33/577GK103048456SQ20121037696
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者張年 申請人:武漢康珠生物技術(shù)有限公司