專利名稱：一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
食品與人類的生存和健康密切相關(guān)，保證食品的安全衛(wèi)生、防止有毒有害物質(zhì)通過食品對人體造成危害是至關(guān)重要的。臘樣芽胞桿菌是一種食源性致病菌，要求在所有的食品中不得檢出。
目前，臘樣芽胞桿菌的測定方法主要是通過增菌培養(yǎng)，然后再通過平板計數(shù)等方法測定，或者通過試劑盒測定，不僅用時長、靈敏度低，而且只能實現(xiàn)半定量。為了判斷食品是否安全，預(yù)防和控制食源性傳染病的傳播以及快速診斷出臘樣芽胞桿菌的存在，研制出一種靈敏度高、特異性強、快速定量的檢測方法是保障食品安全的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種靈敏度高、特異性強、快速定量的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，包括下述步驟( I)將玻碳電極預(yù)處理后，取質(zhì)量百分比濃度為O. 5%的殼聚糖溶液滴滿處理后的玻碳電極表面，于45°C干燥3h使所述殼聚糖溶液形成包住玻碳電極的凝膠；(2)干燥后自然冷卻至室溫,再浸于濃度為lmol/L的NaOH溶液中5min,用超純水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超純水中30min使NaOH離子徹底進入水中；加入NaOH的目的是催化聚膠，所以聚膠后需要徹底去掉；(3)取出自然晾干后置于納米金溶膠中至少24h，得到納米金電極；(4)將步驟(3)得到的納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，即得單層納米金修飾電極；(5)再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于上述單層納米金修飾電極表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超純水反復(fù)清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下無吸光值；然后置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中4°C自組裝至少24h，之后，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，最后置于濃度為lg/1OOmL的牛血清白蛋白溶液中37°C溫育至少lh，以封閉非特異性位點，以含體積百分比為O. 05%Tween-20的磷酸緩沖液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干即得雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器。所述玻碳電極預(yù)處理包括下述過程將玻碳電極依次分別用Ι.ΟμπκΟ. 3μηι、O. 05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為I : I配置的混合液、無水乙醇、超純水清洗；在lmol/LH2SO4溶液中用掃描范圍為I. O 一 I. 0V、掃描速度為100mV/S的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。所述納米金溶膠通過下述方法得到①制備納米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水沖洗掉殘留的酸液，再用蒸餾水浸泡24h，取出干燥后用含體積百分比為5% 二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，之后用超純水充分沖洗，烘干備用；②根據(jù)Frens法取濃度為O. O lg/1OOmL的氯金·酸溶液IOOmL,加入濃度為lg/1OOmL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，用HCl或K2CO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至7. 0，置于微波爐中低火保持18min，自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆?。所述納米金/辣根過氧化物酶溶液采用下述方法制備用O. IM K2CO3調(diào)節(jié)所述納米金溶膠的pH值至7. O后，取ImL上述pH值為7. O的納米金溶膠與lmL2. Og/L辣根過氧化物酶溶液攪拌2h混勻，4°C靜置過夜。所述硫堇/殼聚糖共聚物溶液通過下述方法制備將2. 5mL質(zhì)量體積百分比為2%的殼聚糖溶液加到320 μ L體積百分比為10%的戊二醛溶液中，混勻后加入0. OlM硫堇溶液200 μ L，最后加入體積百分比為2%的醋酸溶液至總體積為6mL，混勻后即可用于滴涂電極。所述純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體通過下述方法制備蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體腹水，采用蛋白A進行親和層析純化；腹水效價為I : 102400，抗體亞型為I gGl，對蘇云金芽孢桿菌I. 1014、蕈狀芽孢桿菌I. 0856、巨大芽孢桿菌I. 0151均無交叉反應(yīng)。所述王水由濃HC I與濃HNO3按照體積比為3 I的比例配置而成。利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(nèi)進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長λ max在510 550nm波長范圍內(nèi)隨膠體金顆粒大小而變化，據(jù)此可通過最大吸收峰處波長對所制備納米金溶膠顆粒的大小進行粗略的表征；用透射電鏡對所制納米金溶膠顆粒的大小、形狀及分散情況進行進一步精確的表征。所述2. 0g/L辣根過氧化物酶液的制備方法為將0. 02g辣根過氧化物酶溶于O. OlM pH值為7. 4的磷酸緩沖液中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的方法以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體；以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-辣根過氧化物酶(HRP)復(fù)合物固定于上述電極，并吸附抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體構(gòu)建了雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學免疫傳感器，靈敏度高，特異性強，能夠?qū)崿F(xiàn)快速定量檢測。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明的方法可以用于食源性臘樣芽胞桿菌檢測。以下以用于乳源的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法為實施例進行說明。實施例I
I、玻碳電極的預(yù)處理將玻碳電極依次分別用I. O μ m、O. 3 μ m、O. 05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用I : I的HNO3、無水乙醇、超純水清洗。在Imo l/L H2SO4溶液中用掃描范圍為I. O 一 I. 0V，掃描速度為100mV/S的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。上述的穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線滿足下述要求在實驗室條件下預(yù)處理后的電極的循環(huán)伏安曲線的峰電位差應(yīng)在SOmV以下，并盡可能的接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環(huán)境中干燥待用。2、納米金(Nano-Au)溶膠的制備(I)制備納米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，所用王水由濃HC I與濃HNO3按照體積比為3 I混合而成。取出后用大量自來水沖洗殘留酸液，然后用蒸餾水浸泡24h。
(2)取出干燥后用含體積百分比為5% 二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，之后用超純水充分沖洗，烘干備用。(3)根據(jù)Frens法取O. O lg/1 OOmL氯金酸溶液IOOmL,加入lg/1 OOmL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，用HCl或K2CO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至7. 0，置于微波爐中低火保持18min，待其自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆?。利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(nèi)(400-700nm)進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長入_在510 550nm波長范圍內(nèi)隨膠體金顆粒大小而變化，據(jù)此可通過最大吸收峰處波長對所制備納米金溶膠顆粒的大小進行粗略的表征；結(jié)果應(yīng)在518nm波長處有一很強的吸收峰，故可粗略確定納米金平均粒徑為15nm。用透射電鏡對所制納米金溶膠顆粒的大小、形狀及分散情況進行進一步精確的表征，所合成的納米金形狀規(guī)則，粒度均勻，平均粒徑約為15nm，且沒有聚集現(xiàn)象。3、純化的乳源蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體的制備乳源蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體腹水，采用蛋白A進行親和層析純化。腹水效價為I 102400，抗體亞型為IgGl，對蘇云金芽孢桿菌I. 1014、蕈狀芽孢桿菌I. 0856、巨大芽孢桿菌I. 0151均無交叉反應(yīng)。4、硫堇/殼聚糖(Thi/Chit)共聚物的制備(I)將2g殼聚糖(Chit)溶于IOOmL體積百分比為2%的醋酸溶液中攪拌3h得到2%的殼聚糖溶液。(2)將上述2. 5mL質(zhì)量體積百分比為2%的殼聚糖溶液加到320 μ L體積百分比為10%的戊二醛溶液中，混勻后加入O. OlM硫堇(Thi)溶液200yL，最后加入2%(ν/ν)的醋酸溶液至總體積為6mL，混勻后即可用于滴涂電極，且該共聚物溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。5、納米金吸附辣根過氧化物酶的制備(I)將O. 02g辣根過氧化物酶(HRP)溶于O. OlM pH值為7. 4的磷酸緩沖液(PBS)中，配置2. Og/L辣根過氧化物酶溶液。(2)用0. IM K2CO3調(diào)節(jié)步驟2制備的納米金溶膠的pH值至7. O后，取ImL上述pH值為7. O的納米金溶膠與ImL上述2. 0g/L辣根過氧化物酶溶液攪拌2h混勻，4°C靜置過夜，并利用分光光度計對此混合液在350 700nm范圍內(nèi)進行掃描，獲得HRP/Nano-Au聚合物的吸收光譜，通過最大吸收波長對Nano-Au與HRP相互作用后所發(fā)生的變化情況進行表征；利用生物薄膜干涉技術(shù)分析Nano-Au對HRP的親和力，亦即紫外-可見吸收光譜?？捎脕肀碚鞯鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用，表明納米金吸附固定HRP對HRP的結(jié)構(gòu)沒有影響，可以很好的保持HRP的生物活性。6、乳源蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備(I)將O. 5g殼聚糖溶于IOOmL體積分數(shù)為1%的醋酸溶液，得到質(zhì)量體積百分比為
O.5%殼聚糖溶液。(2)取5 μ L上述質(zhì)量體積百分比為O. 5%的殼聚糖溶液滴于步驟I預(yù)處理后的玻碳電極表面，置于45°C烘箱中干燥3h使所述殼聚糖溶液形成包住玻碳電極的凝膠，待其自然冷卻至室溫后浸于lmol/L NaOH溶液中5min催化聚膠,用超純水清洗后并浸于超純水中30min,使NaOH全部進入水中。
(3)取出自然晾干后置于步驟2制備的納米金溶膠中24h，得到納米金電極。然后將該電極置于步驟3所純化的乳源蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝24h，即得單層納米金修飾的電極。(4)再取5 μ L步驟4中所制備的硫堇/殼聚糖(Thi/Chit)共聚物溶液滴加于單層納米金修飾的電極表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超純水反復(fù)清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下無吸光值；然后置于步驟5所制備的納米金/辣根過氧化物酶溶液中4°C自組裝24h，超純水沖洗后再置于步驟3所純化的乳源蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝24h，最后置于lg/100mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)溶液中于37°C溫育Ih,以封閉非特異性位點，以含O. 05%(v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干即得雙層納米金修飾的乳源蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器，保存于4°C PBS緩沖液中。將上述組裝好的蠟樣芽孢桿菌電化學免疫傳感器在I X 103cfu/mL蠟樣芽孢桿菌的PBS稀釋液中連續(xù)測定12次，結(jié)果相對標準偏差R. S. D為3. 23%，證明該傳感器的誤差較小，定量效果較好。將該傳感器于O. Olmo 1/L pH值為7. 4的PBS緩沖液上方4°C保存，間歇性使用，第20天電流響應(yīng)信號為初始電流的93. 56%，表明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。取不同批次制備的免疫傳感器5支，在相同條件下對同一濃度菌液(IXlO3Cfu/mL)進行測定，結(jié)果響應(yīng)電流的相對標準偏差R. S. D. =4. 12%，說明該傳感器重現(xiàn)性良好。本發(fā)明以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體，以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-HRP復(fù)合物固定于上述電極并吸附抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體構(gòu)建雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學免疫傳感器。利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法表征電極組裝的各個階段，利用計時電流法對蠟樣芽孢桿菌進行測定，該傳感器的響應(yīng)電流與菌濃度在5X IO1 5X 104cfu/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為O. 9966，檢測限為10cfu/mL。本發(fā)明結(jié)合電化學分析可實現(xiàn)在線檢測，不受樣品濁度、顏色的影響，所需設(shè)備儀器相對簡單，無需對樣品進行純化、富集等預(yù)處理，可應(yīng)用于蠟樣芽胞桿菌的快速檢測。由于本發(fā)明所應(yīng)用的是蠟樣芽胞桿菌特異性蛋白的單克隆抗體，所以決定了其很強的特異性，和其他菌酶有交叉反應(yīng)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出的是，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.ー種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括下述步驟 (1)將玻碳電極預(yù)處理后，取質(zhì)量百分比濃度為O.5%的殼聚糖溶液滴滿處理后的玻碳電極表面，于45°C干燥3h使所述殼聚糖溶液形成包住玻碳電極的凝膠； (2)干燥后自然冷卻至室溫,再浸于濃度為Imo1/L的NaOH溶液中5min,用超純水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超純水中30min使NaOH離子徹底進入水中； (3)取出自然晾干后置于納米金溶膠中至少24h，得到納米金電極； (4)將步驟(3)得到的納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，即得單層納米金修飾電極； (5)再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于上述單層納米金修飾電極表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超純水反復(fù)清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下無吸光值；然后置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中4°C自組裝至少24h，之后，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，最后置于濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液中37 °C溫育至少lh，以封閉非特異性位點，以含體積百分比為O.05%Tween-20的磷酸緩沖液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干即得雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述玻碳電極預(yù)處理包括下述過程將玻碳電極依次分別用I. O μ m>0. 3 μ m>0. 05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為I : I配置的混合液、無水こ醇、超純水清洗；在lmol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為I. O ー I. 0V、掃描速度為IOOmV/s的循環(huán)伏安法活化電極,重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述納米金溶膠通過下述方法得到 ①制備納米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水沖洗掉殘留的酸液，再用蒸餾水浸泡24h，取出干燥后用含體積百分比為5% ニ氯ニ甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，之后用超純水充分沖洗，烘干備用； ②根據(jù)Frens法取濃度為O.Olg/1OOmL的氯金酸溶液IOOmL,加入濃度為lg/100mL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，用HC I或K2CO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至7. O,置于微波爐中低火保持ISmin,自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的乳源蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述納米金/辣根過氧化物酶溶液采用下述方法制備用0. IMも(03調(diào)節(jié)所述納米金溶膠的pH值至7. O后，取ImL上述pH值為7. O的納米金溶膠與ImL 2. 0g/L辣根過氧化物酶溶液攪拌2h混勻，4°C靜置過夜。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述硫堇/殼聚糖共聚物溶液通過下述方法制備將2. 5mL質(zhì)量體積百分比為2%的殼聚糖溶液加到320 μ L體積百分比為10%的戊ニ醛溶液中，混勻后加入0. OlM硫堇溶液200μ L，最后加入體積百分比為2%的醋酸溶液至總體積為6mL，混勻后即可用于滴涂電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在干，所述純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體通過下述方法制備蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體腹水，采用蛋白A進行親和層析純化；腹水效價為I : 102400，抗體亞型為IgGl，對蘇云金芽孢桿菌I. 1014、蕈狀芽孢 桿菌I. 0856、巨大芽孢桿菌I. 0151均無交叉反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述王水由濃HCl與濃HNO3按照體積比為3 I的比例配置而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(nèi)進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長Xmax在510 550nm波長范圍內(nèi)隨膠體金顆粒大小而變化，據(jù)此可通過最大吸收峰處波長對所制備納米金溶膠顆粒的大小進行粗略的表征；用透射電鏡對所制納米金溶膠顆粒的大小、形狀及分散情況進行進ー步精確的表征。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述2. Og/L辣根過氧化物酶液的制備方法為將0. 02g辣根過氧化物酶溶于0. OlM pH值為7. 4的磷酸緩沖液中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，提供一種靈敏度高、特異性強、快速定量的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法。取殼聚糖溶液滴滿玻碳電極表面，于45℃干燥3h；冷卻至室溫，浸于NaOH溶液中，用超純水清洗掉NaOH溶液，浸于超純水中；取出自然晾干后置于納米金溶膠中；將納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中自組裝；再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于單層納米金修飾電極表面的中心，干燥后，用超純水清洗；置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中自組裝，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中自組裝，置于牛血清白蛋白溶液中溫育，清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干。
文檔編號G01N33/577GK102854320SQ20121037957
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者龐廣昌, 康曉斌, 陳慶森, 梁新義, 胡志和 申請人:天津商業(yè)大學