專利名稱：葡萄糖傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開內(nèi)容涉及含有米曲霉型FAD-GDH和釕化合物的葡萄糖傳感器。
背景技術(shù)：
作為在應(yīng)用各種葡萄糖氧化酶的葡萄糖定量方法中使用的GDH (葡萄糖氧化酶)，公開了米曲霉的FAD-GDH。(專利文獻(xiàn)I)。報(bào)道稱，米曲霉的野生型FAD-GDH及其變體對(duì)麥芽糖和半乳糖的作用性低，而對(duì)葡萄糖的底物特異性高(專利文獻(xiàn)2)。葡萄糖傳感器等生物傳感器一般而言是在電絕緣性基板上形成包括作用極和對(duì)電極的電極系、并在其上配置包含GDH/G0D等氧化還原酶和媒介體的試劑層而構(gòu)成的(專利文獻(xiàn)3)。作為所述媒介體，使用鐵氰化物/釕化合物等(專利文獻(xiàn)4)。在先技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特許第4292486號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特許第4348563號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:W02005/043146專利文獻(xiàn)4 W02003/025558

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題一直以來，應(yīng)用各種葡萄糖氧化酶類的葡萄糖定量法被進(jìn)行著各種各樣的討論，并被市售。應(yīng)用葡萄糖氧化酶類的葡萄糖定量法的原理是，利用葡萄糖被酶氧化的同時(shí)該氧化酶類的輔酶被還原的事實(shí)，具體而言，分類為測(cè)定被還原的輔酶或電子傳遞物質(zhì)的吸光度的方法(比色法)和測(cè)定通過氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生的電流的方法(電極法)。特別是近年來，作為用于糖尿病患者日常掌握自己血糖值的簡易型血糖傳感器，主要使用電極法。作為葡萄糖氧化酶類，很早以來就應(yīng)用葡萄糖氧化酶(G0D)。但是，在將GOD應(yīng)用于電極法的情況下，存在如下問題因?yàn)镚OD可能以分子氧作為電子受體，試樣中的溶解氧濃度將影響定量值。作為解決該問題的方法，多使用不以分子氧為電子受體的葡萄糖脫氫酶(O)H)。作為⑶H，大致上分類為三種類型以吡咯并喹啉醌(PQQ)作為輔酶的物質(zhì)(PQQ-GDH)、以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔酶的物質(zhì)(FAD-GDH)、以煙酰胺腺嘌呤ニ核苷酸(MD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作為輔酶的物質(zhì)(NAD(P)-GDH)。GDH經(jīng)常有底物特異性的問題。即，已知GDH將葡萄糖以外的麥芽糖/半乳糖也作為底物。作為能解決該底物特異性問題的GDH，發(fā)現(xiàn)了米曲霉的FAD-GDH(專利文獻(xiàn)I)。因?yàn)槊浊沟囊吧虵AD-GDH及其變體(專利文獻(xiàn)2)對(duì)麥芽糖和半乳糖的作用性低而對(duì)葡萄糖的底物特異性高，故而提出將其應(yīng)用于葡萄糖傳感器。葡萄糖傳感器等生物傳感器一般而言是在電絕緣性基板上形成包括作用極和對(duì)電極的電極系、并在其上配置包含GDH/GOD等氧化還原酶和媒介體的試劑層而構(gòu)成的(專利文獻(xiàn)3)。作為所述媒介體，使用鐵氰化物/釕化合物等(專利文獻(xiàn)4)?？赏ㄟ^將米曲霉的野生型FAD-GDH及其變體(下文中也稱為“米曲霉型FAD-GDH”)與鐵氰化物等媒介體(但釕化合物除外)組合，來制作能測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器(例如，專利文獻(xiàn)I和2)。另外，如果前述的釕化合物與米曲霉型FAD-GDH以外的GDH或GOD組合的話，也能制作能測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器(例如，專利文獻(xiàn)3和4)。但是，米曲霉型FAD-GDH和作為媒介體的釕化合物組合吋，會(huì)有無法制作能夠測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器的問題。組合了米曲霉型FAD-GDH和釕化合物的葡萄糖傳感器不能測(cè)定葡萄糖濃度的問題迄今尚未知。因此，本文公開內(nèi)容中，作為一種實(shí)施方式,米曲霉型FAD-GDH和釕化合物組合使用的情況下也能提供能測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器。解決問題的手段本文公開內(nèi)容中，作為ー種實(shí)施方式，涉及ー種葡萄糖傳感器(下文中也稱為“本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器”)，其具備絕緣性基板、所述基板上配置的包括作用極和對(duì)電極的電極系以及所述電極系上配置的試劑層，所述試劑層包含米曲霉型FAD-GDH、釕化合物和PMS (吩嗪硫酸甲酷)。本文公開內(nèi)容中，作為其它實(shí)施方式，涉及葡萄糖濃度測(cè)定方法(下文中也稱為“本文公開內(nèi)容的葡萄糖濃度測(cè)定方法”)，所述方法是應(yīng)用絕緣性基板上配置的包括作用極和對(duì)電極的電極系、葡萄糖脫氫酶和媒介體來測(cè)定試樣中的葡萄糖的方法，其包括使所述試樣與米曲霉型FAD-GDH接觸，以及借助于PMS和釕化合物、電化學(xué)地測(cè)定所述試樣中的葡萄糖與所述米曲霉型FAD-GDH的反應(yīng)。本文公開內(nèi)容中，作為其它實(shí)施方式，涉及葡萄糖傳感器的制造方法，所述方法包括在配置有包括作用極和對(duì)電極的電極系的絕緣性基板的所述電極系上，形成包含米曲霉型FAD-GDH、釕化合物和PMS的試劑層。本文公開內(nèi)容中，作為其它實(shí)施方式，涉及葡萄糖濃度測(cè)定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)用于測(cè)定試樣中的葡萄糖濃度，其包含本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器、和向所述葡萄糖傳感器的電極系施加電壓的單元、和用于測(cè)定電極系中電流的單元。發(fā)明效果根據(jù)本文公開內(nèi)容，作為ー種實(shí)施方式，將對(duì)麥芽糖/半乳糖作用性低但對(duì)葡萄糖的底物特異性高的米曲霉型FAD-GDH和作為媒介體的釕化合物組合使用，能提供能測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器。


圖1示出了兩種類型的媒介體PMS和釕化合物(Ru)介導(dǎo)的通過米曲霉型FAD-GDH的葡萄糖電化學(xué)傳感流程圖。(Ox)表示為氧化型、(Re)表示為還原型。圖2是示出了通過實(shí)施例1和參考例I的葡萄糖傳感器測(cè)定檢測(cè)體試樣時(shí)檢測(cè)到的電流值的時(shí)間歷程(time courses)的圖的ー個(gè)例子。圖3是說明葡萄糖傳感器的構(gòu)成和制造方法的一個(gè)例子的示意圖。圖4是說明葡萄糖傳感器的一個(gè)例子的示意圖。
具體實(shí)施例方式本文公開內(nèi)容的一種實(shí)施方式中，基于下述見解単獨(dú)使用釕化合物作為米曲霉型FAD-GDH的媒介體來制作葡萄糖傳感器的情況下，無法獲得依賴于試樣中的葡萄糖濃度的電流值，無法測(cè)定葡萄糖濃度。另外，本文公開內(nèi)容的一種實(shí)施方式中，基于下述見解即使是前述構(gòu)成的葡萄糖傳感器，除了釕化合物還使用PMS作為媒介體的話，能測(cè)定葡萄糖濃度。米曲霉型FAD-GDH和釕化合物組合的葡萄糖傳感器不能測(cè)定葡萄糖濃度、但在所述組合中添加PMS的葡萄糖傳感器就能測(cè)定葡萄糖濃度的機(jī)制細(xì)節(jié)尚不明確，但認(rèn)為米曲霉型FAD-GDH和釕化合物之間電子傳遞效率不良。另ー方面認(rèn)為，PMS容易從米曲霉型FAD-GDH接受電子，并且容易將電子傳遞至釕化合物，反應(yīng)體系中這三者均存在，所以變得能夠測(cè)定葡萄糖濃度。即，本文公開內(nèi)容中米曲霉型FAD-GDH和葡萄糖的反應(yīng)的電化學(xué)測(cè)定流程被認(rèn)為是圖1中的那樣。首先，米曲霉型FAD-GDH通過與葡萄糖的反應(yīng)被供給的電子被供給至作為第一媒介體的PMS (氧化型)，使得PMS成為還原型。接著，從還原型PMS向作為第二媒介體的釕化合物(Ru)(氧化型)供給電子，使得釕化合物成為還原型。然后，從還原型釕化合物向電極(作用扱)供給電子，測(cè)定電流值。但是，也可不將本文公開內(nèi)容解釋為限定于這些機(jī)制。[米曲霉(Aspergillusoryzae)型 FAD-GDH]本說明書中，“ FAD-GDH”表示黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶或黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。本說明書中，“米曲霉型FAD-GDH”表示米曲霉的野生型FAD-GDH和/或其變體，在沒有特別記載的情況下，包含野生型及其變體兩者。本說明書中，“米曲霉型FAD-GDH”優(yōu)選表示較之之前公知的FAD非結(jié)合型GDH而言對(duì)麥芽糖和半乳糖的作用性更低、并且對(duì)葡萄糖的底物特異性更高的FAD-GDH。作為米曲霉的野生型FAD-GDH，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出序列表的序列編號(hào)I的氨基酸序列所表示的公知的蛋白質(zhì)。本說明書中，米曲霉的野生型FAD-GDH的變體是具有取代所述野生型FAD-GDH的氨基酸序列的氨基酸殘基而得到的序列、且具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶活性的變體。所述變體優(yōu)選與野生型同樣地對(duì)麥芽糖和半乳糖的作用性低，并且優(yōu)選地對(duì)葡萄糖的底物特異性高。所述取代氨基酸殘基的數(shù)目例如為1、2、3、4、5個(gè)，優(yōu)選I 3個(gè)，更優(yōu)選I 2個(gè)。本說明書中的米曲霉型FAD-GDH可以使用市售品。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以舉出實(shí)施例中使用的東洋紡社制的米曲霉型FAD-GDH。另外，作為本說明書中的米曲霉型FAD-GDH的實(shí)施方式，可以舉出專利文獻(xiàn)I和2中所記載的。本說明書中，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，米曲霉型FAD-GDH可包含具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶活性、且為了酶精制的目的在氨基酸序列的N末端或C末端添加了標(biāo)簽序列、肽序列和/或這些序列的截短片段的重組體。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，每I個(gè)葡萄糖傳感器中的米曲霉型FAD-GDH含量可以是之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中配置的量，從生產(chǎn)力(成本)和維持檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來看，0.5 IOU是優(yōu)選的，更優(yōu)選為I 6U，進(jìn)ー步優(yōu)選為I 4U。另外，本說明書中，U是酶的單位，IU是米曲霉型FAD-GDH于37°C在I分鐘內(nèi)氧化I U mo I葡萄糖的酶量。另外，本說明書中，“每I個(gè)葡萄糖傳感器中的含量”在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中指具有ー套具有作用極和對(duì)電極的電極系的葡萄糖傳感器中使用的量，在進(jìn)ー步的ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中指一套電極系上配置的試劑層中含有的量，在更進(jìn)一歩的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中指使得添加試樣時(shí)(使用吋)反應(yīng)體系中含有試劑而配置的量。另外，本說明書中，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，提到“毎I個(gè)葡萄糖傳感器中的含量”時(shí)的葡萄糖傳感器指對(duì)血液試樣所使用的通常的尺寸的葡萄糖傳感器。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，所述尺寸指，添加的血液試樣為例如0. 2 1. 0 ii L、或者0. 2 0. 4 ii L時(shí)的尺寸，或者，血液試樣與試劑層接觸而形成的反應(yīng)體系的容量例如為0. 2 1. 0 ii L或者0. 2 0. 4 ii L時(shí)的尺寸。由此，在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，“每I個(gè)葡萄糖傳感器中的含量”可根據(jù)電極系的數(shù)目和/或試樣或反應(yīng)體系的容量，而適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)本說明公開的范圍。[釕化合物]作為本說明書中的“釕化合物”，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器/生物傳感器中使用于媒介體的釕化合物。釕化合物優(yōu)選地能以氧化型的釕絡(luò)合體的形式存在于反應(yīng)體系中。作為所述釕絡(luò)合體，只要作為媒介體(電子傳遞體)的機(jī)能則對(duì)其配體的類型沒有特別限制，但使用下述化學(xué)式所示作為氧化型是優(yōu)選的。[Ru(NH3)5X]11+所述化學(xué)式中，作為X可舉出NH3、齒素離子、CN、吡啶、煙酰胺或H20，NH3或鹵素例子(例如Cl—、F—、Br—、I—)是優(yōu)選的。所述化學(xué)式中，n+表示根據(jù)X的類型而決定的氧化型釕(III)絡(luò)合體的價(jià)數(shù)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，每I個(gè)葡萄糖傳感器中的釕化合物的含量可以是之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中配置的量，從生產(chǎn)力(成本)和檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來看，5 50 ii g是優(yōu)選的，更優(yōu)選為10 40 ii g，進(jìn)ー步更優(yōu)選為15 25ii g。[PMS]本說明書中，“ PMS”表示吩嗪硫酸甲酷及其衍生物。作為所述PMS，從試劑穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看，1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酷(1-甲氧基PMS)是優(yōu)選的。每I個(gè)葡萄糖傳感器中的PMS含量從生產(chǎn)力(成本)和檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來看優(yōu)選為40 900pmol,更優(yōu)選為50 500pmol,進(jìn)一步優(yōu)選為100 300pmol。每I個(gè)葡萄糖傳感器中的PMS的含量為200pmol的情況下，米曲霉型FAD-GDH的含量在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中為I 6U，或者I 4U，釕化合物的含量在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中為10 40ii g，或者15 25ii g。[試劑層中含有的其它成分]從提高測(cè)定靈敏度的觀點(diǎn)來看，試劑層還可含有層狀無機(jī)化合物、表面活性剤、緩沖劑等。作為所述層狀無機(jī)化合物，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中使用的物質(zhì)，但就同樣的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選具有離子交換能力的膨潤性粘土礦物質(zhì)，更優(yōu)選膨潤土、蒙脫石、蛭石、合成含氟云母等，合成鋰蒙脫石、合成皂石等合成蒙脫石；合成含氟云母等膨潤性合成云母；更優(yōu)選Na型云母等合成云母(天然云母通常是非膨潤性粘土礦物質(zhì))等。這些層狀無機(jī)化合物可単獨(dú)使用，也可兩種以上聯(lián)用。作為所述表面活性剤，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中使用的那些，對(duì)其沒有特別限制，但在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可適合地使用非離子性、陰離子性、陽離子性、兩性的表面活性。其中，從增加測(cè)定靈敏度的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選兩性表面活性剤。作為兩性表面活性劑,例如,可舉出羧基甜菜堿(carboxybetaine)、磺基甜菜堿(sulfobetaine)和磷酸酯甜菜堿(phosphobetaine)等,從同樣的觀點(diǎn)來看,磺基甜菜堿是優(yōu)選的。作為磺基甜菜堿，例如可舉出CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)ニ甲基氨基]丙磺酸)、CHAPS0(3-[(3-膽酰胺丙基)ニ甲基氨基]-2_羥基-1-丙磺酸內(nèi)鹽)和烷基羥基磺酸甜菜堿等，從同樣的觀點(diǎn)來看，CHAPS是優(yōu)選的。作為所述緩沖劑，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中使用的緩沖劑，沒有特別限制，但在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從增加測(cè)定靈敏度的觀點(diǎn)來看，胺系緩沖劑和具有羧基的緩沖劑是優(yōu)選的。作為所述胺系緩沖劑，從同樣的觀點(diǎn)來看，Tris, ACES, CHES,CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine 和 ADA 等是優(yōu)選的，更優(yōu)選為 ACES、Tris，進(jìn)ー步更優(yōu)選是ACES。作為所述具有羧基的緩沖劑，從同樣的觀點(diǎn)來看，こ酸-こ酸鈉緩沖齊U、蘋果酸-こ酸鈉緩沖劑、馬來酸-こ酸鈉緩沖劑、琥珀酸-こ酸鈉緩沖劑等是優(yōu)選的，琥珀酸-こ酸鈉緩沖劑是更優(yōu)選的。這些緩沖劑中，可使用ー種類型，也可聯(lián)用兩種類型以 上。所述試劑層在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以是含有所有試劑的單層結(jié)構(gòu)，也可以是多層的疊層結(jié)構(gòu)。一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，也可以是形成含有所述層狀無機(jī)化合物的無機(jī)凝膠層、在其上形成含有米曲霉型FAD-GDH的酶層的疊層結(jié)構(gòu)的試劑層。從保存穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選葡萄糖傳感器中的所述試劑層優(yōu)選以干燥狀態(tài)被配置于電極系上。[試樣]本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器以及本文公開內(nèi)容的葡萄糖測(cè)定方法中的測(cè)定對(duì)象試樣在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中可以是血液、體液、尿液等生物體試樣，也可以是其它液體試樣。[葡萄糖傳感器]本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器是具有絕緣性基板、在所述基板上配置的具有作用極和對(duì)電極的電極系以及在所述電極系上配置的試劑層的結(jié)構(gòu)。所述電極系在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中也可以具有參照極。所述電極可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中使用的電極，對(duì)其沒有特別限制，但在ー個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作用極和對(duì)電極可以使用碳電扱，也可以使用鉬、金、銀、鎳、鈀等的金屬電極。作為參照極，沒有特別限制，可應(yīng)用電化學(xué)實(shí)驗(yàn)中一般的參照極以及今后開發(fā)的參照極，但在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出飽和甘汞電極、銀-氯化銀等。作為在絕緣性基板上形成電極的方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出通過光刻技術(shù)、絲網(wǎng)印刷、凹版印刷、柔版印刷等印刷技術(shù)在基板上形成電極的技木。另夕卜，作為絕緣性基板的材料，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中使用的材料，對(duì)其沒有特別限制，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出硅、玻璃、環(huán)氧玻璃、陶瓷、聚對(duì)苯ニ甲酸こニ醇酯(PET)、聚苯こ烯、聚甲基丙烯酸酷、聚丙烯、丙烯酸樹脂、聚氯こ烯、聚こ烯、聚丙烯、聚酯和聚酰亞胺等?；趫D3和圖4，來說明關(guān)于本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器的一種實(shí)施方式。圖3的(A) (F)是示出了制造本實(shí)施方式的葡萄糖傳感器的一系列步驟的立體圖。另外，圖4是圖3的(F)所示的葡萄糖傳感器的1-1方向斷面圖。另外，圖3的(A) (F)和圖4中，相同的位置標(biāo)識(shí)相同的符號(hào)。如圖3的(F)和圖4所示，該葡萄糖傳感器配備有基板11、由具有引線部12a的作用極12和具有引線部13a的對(duì)電極13構(gòu)成的電極系、絕緣層14、包含層狀無機(jī)化合物的無機(jī)凝膠層16、包含米曲霉型FAD-GDH的酶層17、具有開口部的間隔件18和具有貫通孔20的外罩19。另外，釕化合物和PMS分別獨(dú)立地被包含在無機(jī)凝膠層16和酶層17中的至少一者中。另外，作為其它實(shí)施方式，無機(jī)凝膠層16和酶層17形成一層試劑層的結(jié)構(gòu)也是可以的。如圖3(B)所示，基板11的一側(cè)的頂部(兩圖中為右側(cè))上面設(shè)有檢測(cè)部15，檢測(cè)部15中，作用極12和對(duì)電極13與基板11的寬方向平行配置。所述兩個(gè)電極的一端分別是引線部12a、13a(兩圖中為左側(cè))，它們被配置為與在檢測(cè)部15中的另端垂直(圖3的(A))。另外，作用極12和對(duì)電極13之間是絕緣部。如圖3(B)所示，配備這樣的電極系的基板11上，除引線部12a、13a和檢測(cè)部15之外，疊層有絕緣層14，在沒有疊層絕緣層14的所述檢測(cè)部15上，依次疊層有無機(jī)凝膠層16和酶層17。由此，如圖3的(E)所示，絕緣層14上，在對(duì)應(yīng)于檢測(cè)部15的位置配置有成為開口部的間隔件18。在間隔件18的上面，配置有外罩19，外罩19的對(duì)應(yīng)于所述開口部的一部分上具有貫通孔20 (圖3的(F))。該葡萄糖傳感器中，作為所述開口部的空間部分、并且所述酶層17和絕緣層14與外罩19之間所夾的空間部分，成為毛細(xì)結(jié)構(gòu)的試樣供給部21。由此，所述貫通孔20成為用于通過毛細(xì)管現(xiàn)象吸入試樣的空氣孔。該葡萄糖傳感器例如能與下述測(cè)定儀器組合使用，所述儀器配備有在某一定時(shí)間內(nèi)加上預(yù)定電壓的單元、對(duì)從所述生物傳感器傳遞的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)定的單元、將所述電信號(hào)計(jì)算為測(cè)定對(duì)象物濃度的計(jì)算單元等等的各種單元。下面針對(duì)該葡萄糖傳感器的使用的一個(gè)例子加以說明。首先，使全血試樣與葡萄糖傳感器的開口部21的一端接觸。因?yàn)樵撻_口部21如前文所述是呈毛細(xì)結(jié)構(gòu)的，而且另一端所對(duì)應(yīng)的外罩19中設(shè)有空氣孔，所以通過毛細(xì)管現(xiàn)象將所述試樣吸引到內(nèi)部。被吸引的所述試樣浸透至檢測(cè)部15上設(shè)置的酶層17，溶解酶層17中的米曲霉型FAD-GDH，然后到達(dá)作為酶層17的下層的無機(jī)凝膠層16的表面。由此，到達(dá)表面的試樣中的葡萄糖、所述FAD-GDH、PMS和釕化合物反應(yīng)。具體而言，作為測(cè)定對(duì)象物的葡萄糖通過所述FAD-GDH而被氧化，通過該氧化反應(yīng)移動(dòng)的電子經(jīng)PMS介導(dǎo)傳遞至釕化合物，形成還原型釕(II)絡(luò)合體。然后，無機(jī)凝膠層16中經(jīng)還原的還原型釕(II)絡(luò)合體與位于無機(jī)凝膠層16下方的電極之間進(jìn)行電子傳受，由此可測(cè)定葡萄糖濃度。[葡萄糖傳感器的制造方法]本文公開內(nèi)容在其它實(shí)施方式中，涉及葡萄糖傳感器的制造方法，所述方法包括在配置有具有作用極和對(duì)電極的電極系的絕緣性基板的所述電極系上形成包含米曲霉型FAD-GDH、釕化合物和PMS的試劑層。通過本文公開內(nèi)容的制造方法，可制造本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器。絕緣性基板、電極系和試劑層的結(jié)構(gòu)和/或含量可與上文所述相同。[葡萄糖濃度的測(cè)定方法]本文公開內(nèi)容在其它實(shí)施方式中，涉及葡萄糖濃度的測(cè)定方法，其是試樣中的葡萄糖濃度的測(cè)定方法，所述方法包括使所述試樣與米曲霉型FAD-GDH接觸，以及借助于PMS和釕化合物電化學(xué)地對(duì)所述試樣中的葡萄糖與所述米曲霉型FAD-GDH的反應(yīng)進(jìn)行測(cè)
本說明書中，針對(duì)“電化學(xué)地測(cè)定”指應(yīng)用電化學(xué)測(cè)定方式的測(cè)定，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出電流測(cè)定法、電位差測(cè)定法、電量分析法等。作為電流測(cè)定法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出測(cè)定因?qū)Ρ贿€原了的電子傳遞物質(zhì)施加電壓而受到氧化時(shí)所產(chǎn)生的電流值的方法。作為本文公開內(nèi)容的葡萄糖濃度測(cè)定方法的一種實(shí)施方式，可將包含所述試樣、所述米曲霉型FAD-GDH、所述PMS和所述釕化合物的反應(yīng)體系直接配置于在絕緣性基板上配置的具有作用極和對(duì)電極的電極系上?；蛘撸鳛槠渌鼘?shí)施方式，也可在所述電極系上配置無機(jī)凝膠層，在其上配置包含所述試樣和所述米曲霉型FAD-GDH的反應(yīng)體系。這種情況下，優(yōu)選兩種類型的所述媒介體存在于所述液相反應(yīng)體系和所述無機(jī)凝膠層中的至少一者中，更優(yōu)選使所述PMS存在于所述反應(yīng)體系中、使所述釕化合物存在于所述無機(jī)凝膠層中。作為本文公開內(nèi)容的葡萄糖濃度測(cè)定方法的優(yōu)選實(shí)施方式，可舉出應(yīng)用本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器進(jìn)行的葡萄糖濃度測(cè)定方法。本文公開內(nèi)容的葡萄糖濃度測(cè)定方法在其它實(shí)施方式中，也可包括將所述試樣和米曲霉型FAD-GDH接觸后對(duì)所述電極系施加電壓，測(cè)定所述施加時(shí)釋放的響應(yīng)電流值，以及基于所述響應(yīng)電流值算出所述試樣中的葡萄糖濃度。作為施加的電壓，沒有特別限制，但在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，是10 700mV、50 500mV或100 400mV。本文公開內(nèi)容的葡萄糖濃度測(cè)定方法在其它實(shí)施方式中，也可以在所述試樣和米曲霉型FAD-GDH接觸后保持非施加狀態(tài)一段預(yù)定的時(shí)間之后再對(duì)所述電極系施加電壓，也可以在所述接觸的同時(shí)對(duì)電極系施加電壓。作為保持非施加狀態(tài)的時(shí)間，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為大于O秒而小于等于30秒，或者大于O秒而小于等于10秒。在本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器和本文公開內(nèi)容的葡萄糖測(cè)定方法中，可適當(dāng)?shù)貞?yīng)用之前或今后開發(fā)的葡萄糖濃度測(cè)定裝置等，來進(jìn)行向電極系的電壓施加、響應(yīng)電流值的測(cè)定以及葡萄糖濃度的計(jì)算。[葡萄糖濃度測(cè)定系統(tǒng)]本文公開內(nèi)容中，在其他實(shí)施方式中，涉及用于測(cè)定試樣中的葡萄糖濃度的葡萄糖測(cè)定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括本文公開內(nèi)容的葡萄糖傳感器、向所述葡萄糖傳感器的電極系施加電壓的單元和用于測(cè)定所述電極系中電流的單元。作為施加單元，只要能與葡萄糖傳感器的電極系導(dǎo)通、施加電壓即可，對(duì)其沒有特別限制，公知的或今后開發(fā)的施加單元均可使用。作為施加單元，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可包括能與葡萄糖傳感器的電極系的觸腳以及直流電源等的電源等。測(cè)定單元是為了測(cè)定施加電壓時(shí)電極系中產(chǎn)生的電流的單元，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，只要能測(cè)定與從葡萄糖傳感器試劑層的釕化合物釋放的電子的量相關(guān)的響應(yīng)電流值即可，可使用之前或今后開發(fā)的葡萄糖傳感器中所使用的單元。下文中，使用實(shí)施例和比較例來進(jìn)一步說明書本文公開內(nèi)容。但是，本文公開內(nèi)容不限定于以下實(shí)施例而解釋。實(shí)施例實(shí)施例1和參考例I如下所示，制作了與圖3的(F)的示意圖相同結(jié)構(gòu)的實(shí)施例1和參考例I的葡萄糖傳感器。首先，作為葡萄糖傳感器的絕緣性基板11，準(zhǔn)備PET制的基板(長50mm、寬6mm、厚250μπι)，其一個(gè)表面上通過絲網(wǎng)印刷，形成由分別具有引線部的作用極12和對(duì)電極13構(gòu)成的碳電極系。接下來，按照下文所述，在所述電極上形成絕緣層14。首先，將絕緣性樹脂聚酯以達(dá)到75重量％的濃度的方式溶解于溶劑卡必醇乙酸酯中，制備絕緣性漿體，再將其絲網(wǎng)印刷到所述電極上。印刷條件是300目絲網(wǎng)、刮刀壓力40kg，印刷量為每Icm2電極面積
0.002mL。另外，在檢測(cè)部15上和引線部12a、13a上不進(jìn)行絲印印刷。由此，通過在90°C進(jìn)行60分鐘加熱處理，形成絕緣層14。
接下來，在沒有形成所述絕緣層14的所述檢測(cè)部15中，按照下文所示形成無機(jī)凝膠層16。首先，制備包含O. 3重量％的合成蒙脫石(商品名“Lucentite SWN”，Co-opChemical公司制)、6· O重量％的釕化合物([Ru (NH3) 6] Cl3,同仁化學(xué)研究所社制)、乙酸鈉和琥珀酸的無機(jī)凝膠形成液(ΡΗ7. 5)。將1. O μ L該無機(jī)凝膠形成液分注至檢測(cè)部15。另外，檢測(cè)部15的表面積為約O. 6cm2，所述檢測(cè)部15中的電極12、13的表面積為約O. 12cm2。然后，使其在30°C干燥，形成無機(jī)凝膠層16。進(jìn)一步地，在所述無機(jī)凝膠層16上形成酶層17。首先，制備包含2. 7U米曲霉型FAD-GDH(商品名 “Glucose dehydrogenase (FAD-dependent) (GLD-351) ”，東洋紡社制)、25重量％的1-甲氧基PMS (同仁化學(xué)研究所社制)、ACES緩沖液(pH7. 5)的酶溶液。將1. O μ L該酶溶液分注至檢測(cè)部15的所述無機(jī)凝膠層16上，在30°C使其干燥，形成酶層17。最后，在絕緣層14上配置具有開口部的間隔件18，并且還在所述間隔件18上配置具有作為空氣孔的貫通孔20的外罩19，制作實(shí)施例1的葡萄糖傳感器。因?yàn)樗鐾庹?9和絕緣層14所夾的間隔件18的開口部的空間是毛細(xì)結(jié)構(gòu)，所以將其作為試樣供給部21。除了所述酶溶液中不含1-甲氧基PMS之外，均與實(shí)施例1相同地制作參考例I的葡萄糖傳感器。每I個(gè)實(shí)施例1的葡萄糖傳感器的含量為，米曲霉型FAD-GDH2. 7U，1_甲氧基PMS500ppm,釕化合物20 μ g。另外,所述酶單位U表示在37°C于I分鐘內(nèi)氧化I μ mo I葡萄糖的酶的量的意思。關(guān)于由此得到的實(shí)施例1和參考例I的生物傳感器，應(yīng)用自身血糖測(cè)定裝置(商品名“GLUC0CARD X-METER”，愛科來公司制)，記錄使其與檢測(cè)體試樣反應(yīng)后測(cè)定的電流值的時(shí)間歷程。所述自身血糖測(cè)定裝置可被連接至性能檢查裝置，累積電流值數(shù)據(jù)。作為檢測(cè)體試樣，使用調(diào)節(jié)了葡萄糖濃度的靜脈全血(葡萄糖濃度45、67、134、336、600mg/dL)。其結(jié)果示于圖2的圖中。圖2的實(shí)施例1的圖所示的五種類型的曲線從下往上示出了試樣中葡萄糖濃度為45、67、134、336和600mg/dL的結(jié)果。如圖2所示，可知采用實(shí)施例1的葡萄糖傳感器，因?yàn)榘l(fā)生了依賴于檢測(cè)體試樣中的葡萄糖濃度的電流值，故而能測(cè)定葡萄糖濃度。另一方面，采用參考例I的葡萄糖傳感器的話，因?yàn)椴荒軠y(cè)定依賴于檢測(cè)體試樣中葡萄糖濃度的電流值的發(fā)生，故而難于測(cè)定葡萄糖濃度。實(shí)施例2和參考例2使用沒有附加與所述FAD-GDH結(jié)合的糖鏈的非糖鏈結(jié)合型米曲霉型FAD_GDH(東洋紡社制)，代替實(shí)施例1和參考例I的米曲霉型FAD-GDH，其它與實(shí)施例1和參考例I相同，來制作實(shí)施例2和參考例2的葡萄糖傳感器。應(yīng)用制作的實(shí)施例2和參考例2的葡萄糖傳感器，與實(shí)施例1相同地，測(cè)定與調(diào)節(jié)了葡萄糖濃度的靜脈全血的檢測(cè)體試樣反應(yīng)后測(cè)定的電流值的時(shí)間歷程。其結(jié)果可知，采用實(shí)施例2的葡萄糖傳感器，發(fā)生了依賴于檢測(cè)體試樣中的葡萄糖濃度的電流值，所以能測(cè)定葡萄糖濃度(數(shù)據(jù)未示出)。另一方面可知，采用參考例2的葡萄糖傳感器的話，不能測(cè)定依賴于檢測(cè)體試樣中的葡萄糖濃度的電流值的發(fā)生，因此難于測(cè)定葡萄糖濃度(數(shù)據(jù)未示出)。參考例3 7分別使用來自釀酒酵母(Sccharomyces cerevisiae)的細(xì)胞色素c (Sigma-Aldrich 公司制)、來自馬心(equine heart)的細(xì)胞色素 c (Sigma-Aldrich 公司制)和乙酰化的來自馬心的細(xì)胞色素c (Sigma-Aldrich公司制)，代替實(shí)施例1的1_甲氧基PMS，其它和實(shí)施例1相同，來制作參考例3 5的葡萄糖傳感器。另外，制作除釕化合物之外其它均與實(shí)施例1相同的葡萄糖傳感器，作為參考例6的葡萄糖傳感器，制作除了不含兩種類型的媒介體之外其它均與實(shí)施例1相同的葡萄糖傳感器，作為參考例7的葡萄糖傳感器。應(yīng)用制作的參考例3 7的葡萄糖傳感器，與實(shí)施例1相同地，測(cè)定與調(diào)整了葡萄糖濃度的靜脈全血的檢測(cè)體試樣反應(yīng)之后測(cè)定的電流值的時(shí)間歷程。其結(jié)果可知，采用參考例3 6的葡萄糖傳感器的話，不能測(cè)定依賴于檢測(cè)體試樣中的葡萄糖濃度的電流值的發(fā)生，因此難于測(cè)定葡萄糖濃度。圖2示出了通過參考例6的葡萄糖傳感器測(cè)定的電流值的時(shí)間歷程的一個(gè)例子。另外，采用參考例7的葡萄糖傳感器無法檢測(cè)到電流值。實(shí)施例1 2和參考率I 7的結(jié)果總結(jié)在下表I中。表I
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖傳感器，其具備絕緣性基板、所述基板上配置的包括作用極和對(duì)電極的電極系以及所述電極系上配置的試劑層，所述試劑層包含米曲霉(Aspergillus oryzae)型FAD-GDH(黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶)、釕化合物和PMS(吩嗪硫酸甲酯)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖傳感器，其中所述米曲霉型FAD-GDH選自由米曲霉的野生型FAD-GDH及其變體構(gòu)成的組，所述變體是具有取代所述野生型FAD-GDH的氨基酸序列中的I 4個(gè)氨基酸殘基而得到的序列、且具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶活性的變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖傳感器，其中所述PMS是1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的葡萄糖傳感器，其中，在以于37°C在I分鐘內(nèi)氧化Iymol葡萄糖的酶量作為IU的情況下，每I個(gè)葡萄糖傳感器中的所述米曲霉型FAD-GDH的含量為I 4U。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的葡萄糖傳感器，其中，每I個(gè)葡萄糖傳感器中的所述PMS的含量為100 300pmol。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的葡萄糖傳感器，其中，每I個(gè)葡萄糖傳感器中的所述釕化合物的含量為15 25 μ go
7.—種葡萄糖濃度的測(cè)定方法，所述方法是試樣中的葡萄糖濃度的測(cè)定方法，所述方法包括使所述試樣與米曲霉型FAD-GDH接觸，以及借助于PMS和釕化合物電化學(xué)地對(duì)所述試樣中的葡萄糖與所述米曲霉型FAD-GDH的反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。
8.權(quán)利要求7所述的葡萄糖濃度的測(cè)定方法，所述測(cè)定方法應(yīng)用權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的葡萄糖傳感器來進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8所述的測(cè)定方法，包括所述接觸后對(duì)所述電極系施加電壓，測(cè)定所述施加時(shí)釋放的響應(yīng)電流值，以及基于所述響應(yīng)電流值算出所述試樣中的葡萄糖濃度。
10.一種葡萄糖傳感器的制造方法，所述方法包括在配置有包括作用極和對(duì)電極的電極系的絕緣性基板的所述電極系上，形成包含米曲霉型FAD-GDH、釕化合物和PMS的試劑層。
11.一種用于測(cè)定試樣中葡萄糖濃度的葡萄糖濃度測(cè)定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的葡萄糖傳感器、向所述葡萄糖傳感器的電極系施加電壓的單元、和測(cè)定電極系中的電流的單元。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葡萄糖傳感器。具體地，本發(fā)明提供了即使在米曲霉型FAD-GDH和釕化合物組合使用的情況下也能測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器。解決手段是下述葡萄糖傳感器，其是具備絕緣性基板、所述基板上配置的包括作用極和對(duì)電極的電極系以及所述電極系上配置的試劑層的葡萄糖傳感器，所述試劑層包含米曲霉型FAD-GDH、釕化合物和PMS(吩嗪硫酸甲酯)。
文檔編號(hào)G01N27/48GK103018292SQ201210380169
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者帆足省吾, 山口武廣 申請(qǐng)人:愛科來株式會(huì)社