專利名稱：高效液相色譜法分析蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種高效液相色譜(HPLC)法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法。
背景技術(shù)：
蛹蟲草(又名北蟲草、北冬蟲夏草)為麥角菌科蟲草屬真菌蛹草菌(Cordyc印s Hiilitaris(L)Link)的干燥子座，是我國特有的名貴藥用真菌，具有擴(kuò)張器官、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、降血壓、抗病原微生物、抗惡性腫瘤等多種藥理活性。腺苷、蟲草素等核苷類成分被作為蟲草質(zhì)量的主要參考指標(biāo)。腺苷(CltlH13N5O4，結(jié)構(gòu)式如下所示的(a))全稱腺嘌呤核苷， 是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，它具有參與人體代謝和生理調(diào)節(jié)的功能。蟲草素(CltlH13N5O3，結(jié)構(gòu)式如下所示的(b))又稱蟲草菌素、3丨-脫氧腺苷，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等作用。
蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素的含量測定是蟲草產(chǎn)品質(zhì)量控制及代謝途徑研究的前提。目前，蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量測定以高效液相色譜法最為普遍，但多采用磷酸鹽溶液與有機(jī)相的混合體系作為流動相，而長期使用鹽相對液相系統(tǒng)傷害較大。劉小芳等人(劉小芳，薛長湖，常耀光.高效液相色譜法測定蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量[J]. 食品科學(xué)，2010, 31 (16) : 172-175)提出了一種新的測定蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量的方法，其流動相由檸檬酸、醋酸、三乙胺混合溶液及乙腈組成，流動相的成分和制備過程較為復(fù)雜。李祥玲等人(李祥玲，胡勁松，陳作紅.HPLC測定人工蛹蟲草及其培養(yǎng)基中蟲草素和腺苷含量[J]·湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(2) :107-110)、毛新亮等人(毛新亮， 鄭國棟，張晨，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測定冬蟲夏草中腺苷、蟲草素、肌肝含量方法的研究[J].中南藥學(xué)，2009,7(12) :895-897)雖用甲醇和水作為流動相，但卻采用梯度洗脫的方式，過程繁瑣。另外，如果采用《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版中腺苷的提取條件對北蟲草子實(shí)體進(jìn)行提取，則提取率偏低。
目前，蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量測定還沒有統(tǒng)一的國標(biāo)方法，因此確立一個(gè)簡便可靠的方法一次性進(jìn)樣同時(shí)分析腺苷和蛹蟲草的含量具有現(xiàn)實(shí)意義。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品置于容器中，用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加超純水將所述標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成若干不同濃度的腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液； 蛹蟲草子實(shí)體供試溶液制備將蛹蟲草子實(shí)體烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品，加入提取液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草子實(shí)體供試溶液； (2)測定分別吸取腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。
2.如權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所述腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法為精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg,置于50 ml容量瓶中，用50ml水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度記為80 μ g/ml ； 將所述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml的腺苷和蟲草素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述精確稱取為精確到O. 0001 g。
4.如權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，蛹蟲草子實(shí)體供試溶液制備為將蛹蟲草子實(shí)體置于40°C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的樣品O. 50 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液后水浴超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20°C、50()0 r/min的離心機(jī)中離心10 min,吸取上清液I ml，經(jīng)O. 45 μ m水相微孔濾膜過濾后直接注入進(jìn)樣瓶以供分析。
5.如權(quán)利要求I或4所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述步驟(I)蛹蟲草子實(shí)體供試溶液制備中，所述提取液為純水。
6.如權(quán)利要求I或4所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述步驟(I)蛹蟲草子實(shí)體供試溶液制備中，所述提取為提取一次，提取時(shí)間為30-40分鐘，提取溫度為30°C。
7.如權(quán)利要求4所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述水浴超聲提取的超聲功率為700W。
8.如權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，高效液相色譜條件為 色譜柱為 XBridgeTM C18(5ym, 4. 6 X 250 mm)； 流動相為甲醇水=16:84 (V:V);流速1. O ml/min ； 進(jìn)樣量10 μ L，自動進(jìn)樣； 柱溫30°C ;檢測波長254 nm。
9.如權(quán)利要求8所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述流動相中的水為超純水。
10.如權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法分析蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述色譜測定過程采用等度洗脫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效液相色譜(HPLC)法測定人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量的方法，具體為1、稱取蛹蟲草干燥子實(shí)體粉末于50ml具塞離心管中并加水，將離心管在水浴中超聲提取，之后離心，取上清液為供試溶液；2、分別稱取一定質(zhì)量的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解制得混合溶液，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；3、含量測定，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液，經(jīng)0.45μm水相微孔濾膜過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。本發(fā)明為評價(jià)蛹蟲草子實(shí)體質(zhì)量提供了一種新的簡便方法。
文檔編號G01N30/02GK102928526SQ201210381609
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者周培, 袁蜜, 支月娥, 徐魯榮, 樂昕 申請人:上海交通大學(xué)