專利名稱：海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂溶性貝類毒素的檢測方法，特別是一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。
背景技術(shù)：
海洋生物毒素(貝類毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物產(chǎn)生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物包括人類產(chǎn)生危害的一大類小分子有毒化學物質(zhì)。針對這些生物毒素，研究者初期主要根據(jù)所引起的中毒癥狀將其分為六大類麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹灣性貝類毒素(DiarrheticShellfish Poisoning, DSP)、神經(jīng)性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、記憶缺失性貝類毒素(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)、西加魚毒素(Ciguatera FishPoisoning, CFP)、藍綠藻毒素。不過隨著研究的深入，新的生物毒素種類不斷被發(fā)現(xiàn)，且多種毒素如OA往往與毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒機理，原有分類方法已不能滿足管理和科研的需求。因此，2004年，由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會共同組建的雙殼類軟體生物毒素工作組將貝類毒素分為八大類，分別為石房蛤毒素組(Saxitoxin, STX)、軟骨藻酸組(Domoic acid, DA)、大田軟海綿酸毒素組(Okadaicacid, 0A)、原多甲酸毒素組(Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素組(Brevetoxin, BTX)、蛤毒素組(Pecenotoxins, PTX)、奸夷扇貝毒素組(Yessotoxin, YTX)和環(huán)亞胺類毒素(Cyclicimines’CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins,P1TX)和西加魚毒素(Ciguatoxins,CTX)也正在被考慮是否劃作貝類毒素中?，F(xiàn)有8大類貝類毒素中，STX和DA毒素組較易溶解于水，比較而言0A、AZA> BTX、PTX、YTX、CIs均為聚醚類物質(zhì)，具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機試劑中，因此被統(tǒng)一稱作為脂溶性貝類毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。貝類毒素的嚴重危害性已引起多個國家的密切關(guān)注，以歐美加等為首的發(fā)達國家相繼制定了貝類毒素監(jiān)控國家計劃。傳統(tǒng)的監(jiān)控方法主要是定期對相關(guān)海域中的雙殼貝類進行貝類毒素的含量及產(chǎn)毒藻種類和數(shù)量進行監(jiān)測，以評估貝類毒素的風險性，對保護消費者安全，確保貝類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展做出了積極貢獻。然而，傳統(tǒng)手段需要采集大量的貝類和藻類樣品才能對貝類毒素做出有效預警，不僅耗費大量的人力物力，而且時效性不強。2004年，MacKenzie等人首次報道了一種固相吸附毒素追蹤技術(shù)(Solid phase adsorption toxin tracking, SPATT),主要是利用特異性吸附材料對目標毒素進行吸附，然后實驗室內(nèi)洗脫、濃縮和凈化后經(jīng)LC-MS檢測。SPATT技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，不僅大量減少采樣分析工作量，而且還可以監(jiān)控目標海域不同水層貝類毒素的變化，同時結(jié)合貝類中毒素和有毒藻的變化情況，對貝類毒素有早期預警作用，具有很大的發(fā)展前景?，F(xiàn)有的檢測技術(shù)主要還是小鼠生物法，存在動物福利以及檢出限高且不能明確辨析貝毒成分等問題，雖然質(zhì)譜檢測技術(shù)也已開始用于貝類毒素的檢測，但檢測種類比較單一，或前處理方法尚需進一步完善。因此建立一種快速、靈敏、準確的多種脂溶性貝類毒素同時檢測方法變得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對性強、操作簡單、檢測速度快、檢測面廣、降低了測試成本、易于推廣應用的海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。本發(fā)明是通過以下 的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定，具體步驟如下(I)吸附袋的制作用聚酯網(wǎng)布，縫制成布袋，裝入樹脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龍掛扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸餾水浸泡去除甲醇，隨即放入密封的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存，待用；(2)吸附袋的使用把吸附袋系在長繩上，分上、中、下三層，層間隔至少超過5米以上，否則相應減少層數(shù)，每層一次固定3個及以上吸附袋，將繩系于固定位置的漂浮桿上，每間隔7-10天將吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸餾水沖洗，放入預先編號的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存；(3)毒素萃取將樹脂填料轉(zhuǎn)入沙芯濾柱中，用50_70mL去離子水洗去鹽分，把柱中水份正壓吹干，加入20mL甲醇，濾入蒸發(fā)瓶中，再加入20mL甲醇重復提取一次，提取液在40°C使甲醇揮發(fā)，殘余l(xiāng)_2mL水，用5mL 二氯甲烷萃取后離心，取出二氯甲烷層，再用5mL 二氯甲烷重復萃取一次，合并兩次二氯甲烷萃取層后用氮吹干，用l.OmL 80%的甲醇定容，以O(shè). 22 μ m的濾膜過濾，進樣高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；(4)測定條件與方式待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2 ；表I液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
權(quán)利要求
1.一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定，其特征在于具體步驟如下 (1)吸附袋的制作用聚酯網(wǎng)布，縫制成布袋，裝入樹脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龍掛扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸餾水浸泡去除甲醇，隨即放入密封的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存，待用； (2)吸附袋的使用把吸附袋系在長繩上，分上、中、下三層，層間隔至少超過5米以上，否則相應減少層數(shù)，每層一次固定3個及以上吸附袋，將繩系于固定位置的漂浮桿上，每間隔7-10天將吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸餾水沖洗，放入預先編號的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存； (3)毒素萃取將樹脂填料轉(zhuǎn)入沙芯濾柱中，用50-70mL去離子水洗去鹽分，把柱中水份正壓吹干，加入20mL甲醇，濾入蒸發(fā)瓶中，再加入20mL甲醇重復提取一次，提取液在40°C使甲醇揮發(fā)，殘余l(xiāng)_2mL水，用5mL 二氯甲烷萃取后離心，取出二氯甲烷層，再5mL 二氯甲烷重復萃取一次，合并兩次二氯甲烷萃取層后用氮吹干，用l.OmL 80%的甲醇定容，以O(shè).22 μ m的濾膜過濾，進樣高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析； (4)測定條件與方式待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2 ； 表I液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
全文摘要
一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定。本發(fā)明檢測方法采用樹脂主動吸附海水中的貝類毒素，且可對海水不同分層進行特異性吸附，后經(jīng)過萃取步驟分析海水中16種脂溶性貝類毒素的檢測。且與傳統(tǒng)方法相比，采樣量少，降低成本，操作簡單方便，穩(wěn)定性強。
文檔編號G01N30/06GK102928529SQ20121038845
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者譚志軍, 吳海燕, 郭萌萌, 李兆新, 王聯(lián)珠, 翟毓秀 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所