專利名稱：一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種游離色氨酸含量的檢測方法，更具體地說，涉及一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
在天然的20種氨基酸中，色氨酸具有至關(guān)重要的意義，例如血清中色氨酸含量的非正常偏高被認(rèn)為是某些疾病產(chǎn)生的關(guān)鍵影響要素，如慢性肝炎、帕金森病、再生障礙性貧血和肌肉萎縮等。所以發(fā)展有效地在活體內(nèi)識別和檢測色氨酸含量，尤其是應(yīng)用于血清樣本中色氨酸含量的檢測方法具有臨床上的意義。然而，設(shè)計合成出具有高選擇性和有效地識別該類重要的生物小分子的探針在目·前是一個極具挑戰(zhàn)的課題，經(jīng)過科學(xué)工作者數(shù)十年的不懈努力，氨基酸分子熒光探針在基礎(chǔ)理論研究方面取得了巨大的進步，實現(xiàn)了對特定目標(biāo)氨基酸的高選擇性的檢測。但是，目前絕大部分的氨基酸識別探針要真正應(yīng)用到現(xiàn)實生產(chǎn)生活中，科學(xué)工作者還需解決如下問題
I.基于弱作用識別過程對氨基酸的識別，其中提高識別過程的選擇性是重點，因為氨基酸及其衍生物都具有相似的結(jié)構(gòu)，從而具有相同的弱作用識別位點，達到對單一氨基酸分子的識別在目前的研究中還有待解決。2.現(xiàn)在大部分高選擇性的氨基酸探針都是基于共價鍵反應(yīng)型機理，對于氨基酸的識別過程同時也伴隨著氨基酸分子結(jié)構(gòu)的變化，識別過程不可逆，不利于現(xiàn)實意義上的檢測應(yīng)用。3.小肽和蛋白質(zhì)對氨基酸識別過程的干擾目前研究的較少，大部分生物樣本中都會含有氨基酸、小肽和蛋白質(zhì)，真正的構(gòu)筑研究生命體系生物小分子的探針刻不容緩。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法。具體是將具有藍色熒光發(fā)射的三苯胺基團作為熒光團和芳香堆積作用位點，協(xié)同天然的酰胺基團作為氫鍵授受體，構(gòu)筑具有特殊親疏水空腔的四面體籠狀結(jié)構(gòu)，不僅可以在20種天然氨基酸中高選擇性的識別色氨酸，小肽的存在對熒光識別過程沒有干擾，而且還將其應(yīng)用到生物活體細胞成像研究，最為有利的是實現(xiàn)了對血清樣本中游離色氨酸含量的熒光法檢測，通過熒光定量檢測生物體內(nèi)的色氨酸。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，所述探針為含有式A的配合物，
[^LJ(A)
式A中，L為含有三苯胺基團作為熒光團，功能酰胺基團作為氫鍵作用位點的配體，具有如下B分子結(jié)構(gòu)式；
權(quán)利要求
1.一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，其特征在于探針含有式A的配合物，[MmLJ(A) 式A中，L為含有三苯胺基團作為熒光團，功能酰胺基團作為氫鍵作用位點的配體，具有如下B分子結(jié)構(gòu)式；
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (a)、按照熒光法對于色氨酸的識別方法； 稱取根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針材料，配制成c μ M的100 ml有機/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有機/水混合溶劑的溶液；量取標(biāo)準(zhǔn)探針溶液2 ml,向其中逐漸加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量達到7.5mM后，熒光增強直至平衡； (b)、按照熒光法對色氨酸的選擇性識別測試方法；取探針材料C μ M,加入色氨酸達到7. 5 mM,其它19種天然氨基酸,包括lie, Arg,Ala, Val, Leu, Pro, Met, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Ser, Gly, Cys, His, Phe 和 Tyr 分別加入15 mM,同時，含有5個色氨酸殘基的13肽(ILPWKWPffff PWRR-NH2)加入80 mM,在350nm處激發(fā)，測試其熒光發(fā)射譜圖； (C)、按照熒光法得到色氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法；稱取根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針材料，配制成c μ M的100 ml有機/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有機/水混合溶劑的溶液； 量取標(biāo)準(zhǔn)探針溶液2 ml,加入計算量的色氨酸溶液,配制成標(biāo)準(zhǔn)測試溶液；上述溶液在350 nm處激發(fā)，測得熒光發(fā)射譜圖，然后以色氨酸的加入量為橫坐標(biāo)，相對熒光強度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線； (d)、熒光法直接檢測血清樣本中色氨酸含量的技術(shù)； 血清樣本從合作醫(yī)院取來后，未經(jīng)任何處理，直接用微量注射器加入到含有C μ M 2 ml的有機/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，在350 nm處激發(fā)，測得熒光增強曲線，按照熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中所含游離色氨酸的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，其特征在于所述濃度C為10 μ M至20 μ Μ，濃度太低熒光發(fā)射峰較差，濃度太高則發(fā)生自淬滅。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，其特征在于所述探針材料所用有機/水混合溶劑選自DMF和水，其比例為9:1或8:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，其特征在于所述配制色氨酸所用有機/水混合溶劑選自DMF和水，其比例為I: I或4:6。
全文摘要
一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，涉及一種游離色氨酸含量的檢測方法。本發(fā)明提供了一種基于熒光功能化的金屬有機四面體化合物應(yīng)用于天然氨基酸和血清樣本中游離色氨酸識別和檢測并實現(xiàn)生物細胞成像應(yīng)用的方法。該方法是以三苯胺為母體構(gòu)筑出的三三齒配體與硝酸鈰自組裝得到四面體化合物為材料，該材料能夠在20種天然氨基酸中高選擇性的識別色氨酸，響應(yīng)范圍在0～0.1mM；另外，該材料還能夠有效地區(qū)分游離的和結(jié)合的色氨酸，實現(xiàn)在血清樣本中對游離色氨酸含量的檢測，也很好的實現(xiàn)了在活體細胞成像上的應(yīng)用。因此，該材料提供了一種靈敏度高、操作簡單的測試血清樣本中游離色氨酸含量的方法。
文檔編號G01N21/64GK102914527SQ20121039076
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者何成, 王健, 武鵬彥, 劉曉花, 段然 申請人:大連理工大學(xué)