專利名稱：一種適合雙向電泳的蚯蚓蛋白樣品制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合雙向電泳的蚯蚓蛋白樣品制備方法。
背景技術(shù)：
蚯蚓在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的功能，能疏松土壤，增加土壤有機(jī)質(zhì)并改善土壤結(jié)構(gòu)，還能促進(jìn)酸性或堿性土壤變?yōu)橹行酝寥?，增加磷等速效成分，使土壤適于農(nóng)作物的生
長(zhǎng)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)。蚯蚓是土壤污染的敏感指示物，對(duì)多種重金屬、有機(jī)農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、放射性污染物等環(huán)境有害物質(zhì)有反應(yīng)指示和積累指示的特殊作用。利用蚯蚓的分子、生物化學(xué)和生理反應(yīng)(生物標(biāo)志物)監(jiān)測(cè)土壤污染情況現(xiàn)已備受關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外利用蚯蚓指示污染物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成的影響主要通過(guò)實(shí)地調(diào)查污染土壤中蚯蚓種群數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)；或是在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過(guò)毒性和繁殖試驗(yàn)研究污染物對(duì)某一種類蚯蚓造成的傷害，即蚯蚓的生態(tài)毒理學(xué)研究。而從分子生物學(xué)，尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究尚且較少。蛋白質(zhì)組學(xué)分析是研究蚯蚓蛋白的自身變化及周圍環(huán)境刺激響應(yīng)的重要技術(shù)手段。其中雙向電泳技術(shù)是在蛋白質(zhì)水平上研究基因表達(dá)產(chǎn)物最有效的方法之一。選擇合適的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵因素之一，樣品的制備直接影響到分離結(jié)果的有效性、可靠性及可重復(fù)性。由于蚯蚓中雜質(zhì)成分復(fù)雜，如色素、多糖和核酸等都會(huì)嚴(yán)重干擾雙向電泳，因此目前還沒(méi)有制備適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品的分析研究，從而導(dǎo)致蚯蚓相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究滯后。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明利用土壤中的蚯蚓為試材，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)樣品制備步驟的大量摸索，建立了一套適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品制備體系，為蚯蚓的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)保障。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟I)取吐泥Id后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨時(shí)間為5_15min ；2)按蚯蚓干粉質(zhì)量與以丙酮為溶劑的溶液A的體積之比為I :10的比例，向蚯蚓干粉中加入適量溶液A充分混合，-20°C靜置8_12h，得到蚯蚓總蛋白樣品；所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質(zhì)為0. 01-0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、10%(w/v)的三氯乙酸；3)步驟2)中所得的蚯蚓總蛋白樣品離心20-30min :4°C，轉(zhuǎn)速12000_15000g，棄上清液；用_20°C下預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液A洗滌沉淀，-20°C靜置l_2h，棄上清液；使用溶液A洗滌沉淀3次以上，直至上清液為無(wú)色透明為止，棄上清液，收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；4)收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；5)將步驟4)中得到的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中振蕩混合l_2min后冰浴冷卻lmin，如此重復(fù)振蕩混合l_2h。裂解緩沖液包括9. 8mol/L尿素(urea)，4%(w/V)的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)，65mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，2%(v/v)的膠條緩沖液(IPG buffer)，1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)。所述裂解緩沖液與蚯蚓總蛋白樣品的質(zhì)量體積比為O. 04g/400 μ L-O. 05g/400 μ L ；6)將步驟5)中混合液離心取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品。使用的樣品裂解液中，尿素作為變性劑能破壞蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，打斷非共價(jià)鍵鏈接。CHAPS是一 種兼性去污劑，能打斷蛋白質(zhì)分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質(zhì)的溶解性。加入DTT是為了打斷二硫鍵，并使所有蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)。PMSF是一種蛋白酶抑制劑，能有效抑制絲氨酸蛋白酶以及巰基蛋白酶的活性，防止目標(biāo)蛋白的降解。所使用的膠條緩沖液能通過(guò)電荷間的相互作用減少蛋白質(zhì)結(jié)合，從而增加蛋白質(zhì)可溶性。本發(fā)明的有益效果在于采用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白質(zhì)，并且增加蛋白清洗次數(shù)，可以有效去除鹽離子、多糖、脂類、核酸等干擾電泳的物質(zhì)。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，進(jìn)行雙向電泳分析獲得了重復(fù)性好、分辨率高的電泳圖譜。便于后續(xù)的質(zhì)譜分析鑒定，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖I為蚯蚓總蛋白樣品雙向電泳圖譜
具體實(shí)施例方式以下實(shí)例中未詳盡描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。應(yīng)理解以下實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例II.樣品制備I)取吐泥Id后的3條性成熟赤子愛(ài)勝蚓于液氮中快速研磨10min(液氮添加量以能凍住蚯蚓并可研磨成蚯蚓干粉末為準(zhǔn))，將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，O. 2g/管；每管加入2mL以丙酮為溶劑的溶液A (溶質(zhì)為0. 01-0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、10% (w/v)的三氯乙酸)，充分漩渦混合，-20°C靜置IOh ;靜置后的蚯蚓總蛋白樣品離心30min :4°C，轉(zhuǎn)速12000g，棄上清液；將_201下預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液A與所得沉淀充分混合，洗滌沉淀，-20°C靜置l_2h，棄上清液；洗滌步驟重復(fù)3次以上，直至上清液為無(wú)色透明為止；收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物。2)將上述所得的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中(裂解液包括9. Smol/L尿素,4% (w/v)的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，65mmol/L 二硫蘇糖醇，2%(v/v)膠條緩沖液(IPGbuffer), 1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)),所用裂解液與Φ丘蝴總蛋白樣品的體積質(zhì)量比為O. 045g/400 μ L0振蕩混合Imin后冰浴冷卻lmin,如此重復(fù)振蕩混合2h ;所得混合液離心60min :15°C，轉(zhuǎn)速14000g ;取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品；-20°C保存?zhèn)溆谩?.雙向電泳檢測(cè)I)水化上樣吸取50μ L蚯蚓總蛋白樣品，加入到260μ L的水化液中，充分混合，混合液離心IOmin: 15°C，轉(zhuǎn)速10000r/min;取離心后所得的350 μ L上清液，加入到IPG膠條泡漲盤中，將ΡΗ4-7，18cm的膠條膠面朝下放入泡漲盤中，保證膠面與樣品液之間無(wú)氣泡產(chǎn)生。膠條與水化液充分接觸O. 5h后，加l_2mL覆蓋油，20°C水化10_12h。水化液包括8mol/L尿素，2% (w/v)的3_[3_(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，18mmol/L 二硫蘇糖醇,2% (v/v)膠條緩沖液(IPG buffer) ,0. 05%(w/v)的溴酹藍(lán)。2)等電聚焦水化結(jié)束后將膠條轉(zhuǎn)移至Ettan IPGhor膠條槽中，進(jìn)行等電聚焦。等點(diǎn)聚焦程序設(shè)置為step,500VXlh !Gradient，1000VX Ih gradient, 8000VX 20000Vh ；Gradient,8000VX60000Vh ；3)膠條平衡將聚焦好后的IPG膠條進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法，每次平衡15min，平衡緩沖液配制如下膠條平衡液母液6mol/L尿素,2% (w/v)十二燒基磺酸鈉，50mol/LpH8. 8的Tris-HCL, 30%(v/v)的甘油，O. 002% (w/v)的溴酚藍(lán)，溶劑為去離子水。 膠條平衡緩沖液I :每IOmL膠條平衡液緩沖液母液加入IOOmgDTT。膠條平衡緩沖液II :每IOmL膠條平衡液緩沖液母液加入400mgIAA。4) SDS-PAGE電泳將平衡結(jié)束后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12. 5% (w/v)已聚合的聚丙烯酰胺分離膠上，以恒功率方式進(jìn)行電泳先5W電泳20min，然后功率調(diào)制20W，繼續(xù)電泳5h.。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。5)凝膠染色、脫色將剝離的凝膠置于含40%(v/v)乙醇，10%(v/v)乙酸的固定液中固定 2-3h，之后轉(zhuǎn)入含有 O. 08%(w/v) R-250,8%(w/v)硫酸銨，I. 6%(w/v)磷酸和 20%(v/v)甲醇的染色液染色12h，換脫色液A(l. 2%(w/v)的pH6. 5TrIs-H3PO4)脫色，之后換脫色液B(25%(v/v)甲醇)中脫色，直至背景為無(wú)色透明，蛋白點(diǎn)清晰為止。6)使用掃描儀對(duì)脫色后的凝膠進(jìn)行掃描、拍照。結(jié)果表明該蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品制備和分離效果較好，最終獲得分辨率較高，重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜(圖I)。實(shí)施例2一種雙向電泳蚯蚓總蛋白樣品制備方法，與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是所用裂解液與蚯蚓總蛋白樣品的質(zhì)量體積比為O. 04g/400 μ L。利用實(shí)施例I中2)雙向電泳檢測(cè)方法的結(jié)果表明該蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品制備和分離效果較好，與雙向電泳圖譜與圖I高度相似。實(shí)施例3一種雙向電泳蚯蚓總蛋白樣品制備方法，與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是所用裂解液與蚯蚓總蛋白樣品的質(zhì)量體積比為O. 05g/400 μ L。利用實(shí)施例I中2)雙向電泳檢測(cè)方法的結(jié)果表明該蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品制備和分離效果較好，與雙向電泳圖譜與圖I高度相似。
權(quán)利要求
1.一種制備蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品的方法，其特征在于包括以下步驟 1)取吐泥Id后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨時(shí)間為5-15min； 2)按蚯蚓干粉質(zhì)量與以丙酮為溶劑的溶液A的體積之比為I:10的比例，向蚯蚓干粉中加入適量溶液A充分混合，-20°C靜置8-12h，得到蚯蚓總蛋白樣品； 所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質(zhì)為0. 01-0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、10% (w/v)的三氯乙酸； 3)步驟2)中所得的蚯蚓總蛋白樣品離心20-30min:4°C，轉(zhuǎn)速12000_15000g，棄上清液；用_20°C下預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液A洗滌沉淀，-20°C靜置l_2h，棄上清液；使用溶液A洗滌沉淀3次以上，直至上清液為無(wú)色透明為止，棄上清液，收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；· 4)收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物； 5)將步驟4)中得到的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中振蕩混合l_2min后冰浴冷卻Imin,如此重復(fù)振蕩混合l_2h ;裂解緩沖液包括9. 8mol/L尿素(urea), 4%(w/v)的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)，65mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，2%(v/V)的膠條緩沖液(IPG buffer)，1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF);所述裂解緩沖液與蟲丘蟲引總蛋白樣品的質(zhì)量體積比為O. 04g/400 μ L-0. 05g/400 μ L ； 6)將步驟5)中混合液離心取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品制備的方法。以蚯蚓為試材，于液氮中快速研磨，制得蚯蚓干粉。向蚯蚓干粉中加入以丙酮為溶劑的10%(w/v)的三氯乙酸，之后將-20℃下預(yù)冷的以丙酮為溶劑的10%(w/v)的三氯乙酸與所得沉淀充分混合，洗滌沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物。最后加入樣品裂解液充分混合，離心取上清，制得適合雙向電泳的高質(zhì)量的蚯蚓總蛋白樣品。本發(fā)明制備蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品的方法可獲得分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白，為蚯蚓蛋白組學(xué)研究提供重要技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102914460SQ20121039364
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者王金花, 葛偉麗, 朱魯生, 王軍, 謝慧, 王慧 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)