蛋白質(zhì)微陣列芯片的臨界值一級(jí)參考品的制備方法、臨界值系數(shù)的確定和實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法
【專利摘要】本發(fā)明以利用蛋白質(zhì)微陣列芯片-化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)多種自身抗體并行檢測(cè)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為研究對(duì)象，為此類技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定提供了一種新思路。本發(fā)明包括：利用臨界血清配制臨界值一級(jí)參考品；利用臨界值一級(jí)參考品確定陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)的臨界值系數(shù)；利用每次實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照品的信號(hào)值與臨界值系數(shù)確定各自身抗體指標(biāo)的臨界值信號(hào)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出判定。本發(fā)明還公開了臨界值一級(jí)參考品的制備方法和臨界值系數(shù)確定方法。
【專利說明】蛋白質(zhì)微陣列芯片的臨界值一級(jí)參考品的制備方法、臨界值系數(shù)的確定和實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的臨界值一級(jí)參考品的制備方法、臨界值系數(shù)的確定方法以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]隨著人們對(duì)自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)的研究深入，發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病累及全身各個(gè)系統(tǒng)，種類多達(dá)40余種，自身免病患者中，有很大一部分病人的血清或其它體液中可檢測(cè)到一種或多種高效價(jià)的自身抗體，自身抗體數(shù)量達(dá)到上百種(World I Gastroenterol, 2010.16:3616-3629.)0 自身抗體檢測(cè)對(duì) AID 的輔助診斷、病情評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)以及預(yù)后判斷均具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003]蛋白芯片微陣列技術(shù)(Protein Microarray)作為一種高通量、高靈敏度、特異性強(qiáng)、快速便捷的檢測(cè)分析方法，在以自身抗體為特征的自身免疫性疾病的診斷、鑒別與篩查中得到了廣泛應(yīng)用，目前常見的商業(yè)化蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)平臺(tái)有FIDIS (微珠芯片)(Ann Biol Clin (Pairs) 2005，63:51-58.), AtheNA (微珠芯片)，Luminex 和 Bio-Rad等公司研發(fā)的自身抗體檢測(cè)系統(tǒng)(Anal Bioanal Chem.2009.393:1407-1416.)。此類芯片能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行并行檢測(cè)分析，產(chǎn)品性能與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，但自動(dòng)化程度和檢測(cè)速度明顯提高，標(biāo)本用量減少，更加適合臨床常規(guī)自身抗體的檢測(cè)需求。
[0004]近來年蛋白質(zhì)微陣列芯片的多重新技術(shù)發(fā)展迅速，且既可用于實(shí)驗(yàn)室研究又可用于臨床常規(guī)分析，該技術(shù)的敏感度和特異度不斷得到提升(Arhtritis Rheum,2005，52:2645-2655.)，蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)似乎是未來自身抗體分析的首選方法。
[0005]利用蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)樣本所得測(cè)量值是連續(xù)的數(shù)值，臨界參考值(cut-off)的確定對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判斷有密切關(guān)系，也直接影響蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)的靈敏度與特異度，因而臨界參考值的研究在蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)平臺(tái)中至關(guān)重要。
[0006]在自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的臨界值(cut-off )研究中,有文獻(xiàn)報(bào)道(ClinicalChemistry.2004.50(2):416-422.),利用Human IgG的濃度-灰度標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取各個(gè)自身抗體指標(biāo)的臨界值(cut-off)范圍內(nèi)所有共有的最低灰度值所對(duì)應(yīng)的Human IgG的濃度作為臨界值對(duì)照品的濃度，當(dāng)被測(cè)樣本中自身抗體指標(biāo)的信號(hào)值大于臨界值對(duì)照品信號(hào)值時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，反之，則結(jié)果判斷為陰性。也有文獻(xiàn)報(bào)道，通過大量健康人陰性血清檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，計(jì)算出每個(gè)自身抗體指標(biāo)的臨界信號(hào)值(cut-off)，在此后的實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)某個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)信號(hào)值大于該指標(biāo)的臨界信號(hào)值(cut-off)時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，反之，則結(jié)果判斷為陰性。在這兩種自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的臨界值(cut-off)研究中，前者利用Human IgG的濃度-灰度曲線有替代各個(gè)自身抗體指標(biāo)的濃度-灰度曲線是否合理，是值得商榷的。后者將每次實(shí)驗(yàn)過程中引入的信號(hào)波動(dòng)忽略不計(jì)，這與在蛋白質(zhì)微陣列芯片化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)過程中由于實(shí)驗(yàn)操作不能標(biāo)準(zhǔn)化、人為因素較大而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)信號(hào)波動(dòng)較大的實(shí)事不相符合。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]本發(fā)明要解決的問題是之一在于針對(duì)目前在利用蛋白質(zhì)微陣列芯片一化學(xué)發(fā)光法技術(shù)聯(lián)合并行檢測(cè)多個(gè)自身抗體的實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷方法的不足，提供一種臨界值一級(jí)參考品的制備方法。
[0008]本發(fā)明要解決的問題是之二在于提供一種利用上述臨界值一級(jí)參考品確定陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)的臨界值系數(shù)的方法。
[0009]本發(fā)明要解決的問題是之三在于針對(duì)目前在利用蛋白質(zhì)微陣列芯片一化學(xué)發(fā)光法技術(shù)聯(lián)合并行檢測(cè)多個(gè)自身抗體的實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷方法的不足，提供一種科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，有效地消除出每次實(shí)驗(yàn)操作時(shí)引入的信號(hào)偏差對(duì)檢測(cè)結(jié)果判斷的影響，同時(shí)保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定的可靠性、穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品的靈敏度和特異度。
[0010]作為本發(fā)明第一方面的臨界值一級(jí)參考品的制備方法，由以下步驟組成:
[0011](I)選取陽性血清利用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋，使稀釋后的血清中每個(gè)指標(biāo)在利用免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)，其結(jié)果為弱陽性而得到弱陽性血清；
[0012](2)對(duì)按步驟(1)中所得到弱陽性血清作進(jìn)一步梯度稀釋，得到2~5個(gè)濃度梯度
血清；
[0013](3)對(duì)按步驟(2)中所得到的每個(gè)濃度梯度血清，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度梯度血清重復(fù)1 0孔，對(duì)每個(gè)濃度梯度血清樣本中各指標(biāo)的信號(hào)值計(jì)算平均值? 標(biāo)準(zhǔn)差Sti
品；
[0014](4)取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的健康人陰性血清樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陰性血清樣本中各指標(biāo)信號(hào)的百分位數(shù)Py取99分位數(shù)P值；
[0015](5)比較步驟(3)中不同濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的X #n-2S #,a值與步驟(4)步中的匕值，以最接近于匕值的那個(gè)濃度梯度血清的濃度作為制備為各指標(biāo)臨界值參考品濃度；
[0016](6)按照步驟(5)步中確定的各指標(biāo)臨界值參考品濃度，選取陽性血清，用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋制備臨界值一級(jí)參考品。
[0017]在上述臨界值一級(jí)參考品的制備方法中，所述步驟(1)和步驟(6)中的陽性血清為Jo-l、SSA、SSB、Sm、Scl-70、RNP自身抗體指標(biāo)陽性的血清中的一個(gè)或多個(gè)。
[0018]在上述臨界值一級(jí)參考品的制備方法中，所述步驟(2)中，得到4個(gè)濃度梯度血清；所述步驟(5)中是比較步驟(3)中4個(gè)濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的X ffn-2S 值與步驟
(4)步中的Pr值。
[0019]作為本發(fā)明第二方面的利用上述臨界值一級(jí)參考品確定陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)的臨界值系數(shù)的方法，具體由以下步驟組成:
[0020](I)選用陽性對(duì)照品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)10孔，計(jì)算陽性對(duì)照品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值巧;
[0021](2)選用臨界值一級(jí)參考品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)2孔，計(jì)算臨界值一級(jí)參考品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值胃
[0022](3)利用下述公式求取指標(biāo)臨界值系數(shù)[0023]
【權(quán)利要求】
1.臨界值一級(jí)參考品的制備方法，其特征在于，由以下步驟組成: (1)選取陽性血清利用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋，使稀釋后的血清中每個(gè)指標(biāo)在利用免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)，其結(jié)果為弱陽性而得到弱陽性血清； (2)對(duì)按步驟(1)中所得到弱陽性血清作進(jìn)一步梯度稀釋，得到2~5個(gè)濃度梯度血清； (3)對(duì)按步驟(2)中所得到的每個(gè)濃度梯度血清，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度梯度血清重復(fù)10孔，對(duì)每個(gè)濃度梯度血清樣本中各指標(biāo)的信號(hào)值計(jì)算平均值? ，標(biāo)準(zhǔn)差S#s ； (4)取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的健康人陰性血清樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陰性血清樣本中各指標(biāo)信號(hào)的百分位數(shù)匕，取99分位數(shù)P值； (5)比較步驟(3)中不同濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的?tt,,-2S ?^,值與步驟 (4)步中的匕值，以最接近于匕值的那個(gè)濃度梯度血清的濃度作為制備為各指標(biāo)臨界值參考品濃度； (6)按照步驟(5)步中確定的各指標(biāo)臨界值參考品濃度，選取陽性血清，用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋制備臨界值一級(jí)參考品。
2.如權(quán)利要求1所述的臨界值一級(jí)參考品的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)和步驟(6)中的陽性血清為Jo-l、SSA、SSB、Sm、Scl-70、RNP自身抗體指標(biāo)陽性的血清中的一個(gè)或多個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述的臨界值一級(jí)參考品的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，得到4個(gè)濃度梯度血清；所述`步驟(5)中是比較步驟(3)中4個(gè)濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的X #lW,-2S 值與步驟⑷步中的Pr值。
4.利用權(quán)利要求1所述的臨界值一級(jí)參考品確定陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)的臨界值系數(shù)的方法，其特征在于具體由以下步驟組成: (1)選用陽性對(duì)照品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)10孔，計(jì)算陽性對(duì)照品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值Swtt ； (2)選用臨界值一級(jí)參考品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)2孔，計(jì)算臨界值一級(jí)參考品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值I, (3)利用下述公式求取指標(biāo)臨界值系數(shù) 指標(biāo)臨界值系數(shù)=陽性對(duì)照品中該指標(biāo)信號(hào)值的平均值(馬_;) /臨界值參考品該指標(biāo)信號(hào)值的平均值(Siltiw)。
5.用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于:是以利用蛋白質(zhì)微陣列芯片一化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)多種自身抗體并行檢測(cè)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為研究對(duì)象，利用“臨界值公司一級(jí)參考品”確定陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)的“臨界值系數(shù)”，再利用每次實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照品的信號(hào)值與“臨界值系數(shù)”確定各自身抗體指標(biāo)的臨界值信號(hào)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出判定。
6.如權(quán)利要求5所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，具體步驟如下: (O臨界值一級(jí)參考品的制備步驟； (2)利用步驟(1)制備的臨界值一級(jí)參考品，采用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，給陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)確定臨界值系數(shù)步驟； (3)在每次實(shí)驗(yàn)中，利用陽性對(duì)照品中的各指標(biāo)信號(hào)值與對(duì)應(yīng)的各指標(biāo)的臨界值系數(shù)確定此次實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的臨界值信號(hào)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出判定步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，所述臨界值一級(jí)參考品的制備步驟由以下步驟組成； (Ia)選取陽性血清利用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋，使稀釋后的血清中每個(gè)指標(biāo)在利用免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)，其結(jié)果為弱陽性而得到弱陽性血清； (Ib)對(duì)按步驟(Ib)中所得到弱陽性血清作進(jìn)一步梯度稀釋，得到2~5個(gè)濃度梯度血清； (Ic)對(duì)按步驟(Ib)中所得到的每個(gè)濃度梯度血清，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度梯度血清重復(fù)10孔，對(duì)每個(gè)濃度梯度血清樣本中各指標(biāo)的信號(hào)值計(jì)算平均值? 標(biāo)準(zhǔn)差S#品； (Id)取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的健康人陰性血清樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陰性血清樣本中各指標(biāo)信號(hào)的百分位數(shù)Py取99分位數(shù)P值； (Ie)比較步驟(Ic)中不同濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的? #n-2S 值與步驟(Id)步中的己值，以最接近于匕值的那個(gè)濃度梯度血清的濃度作為制備為各指標(biāo)臨界值參考品濃度； (If )按照步驟(Ie)步中確定的各指標(biāo)臨界值參考品濃度，選取陽性血清，用健康人陰性血清進(jìn)行稀釋制備臨界值一級(jí)參考品。
8.如權(quán)利要求7所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，所述步驟(Ia)和步驟(If)中的陽性血清為Jo-l、SSA、SSB、Sm、Scl-70、RNP自身抗體指標(biāo)陽性的血清中的一個(gè)或多個(gè)。
9.如權(quán)利要求7所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，所述步驟(Ib)中，得到4個(gè)濃度梯度血清；所述步驟(Ie)中是比較步驟(Ic)中4個(gè)濃度梯度血清各個(gè)指標(biāo)的? #,,-2S ,值與步驟(Id)步中的已值。
10.如權(quán)利要求7所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，所述利用步驟(1)制備的臨界值一級(jí)參考品，采用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，給陽性對(duì)照品中各自身抗體指標(biāo)確定臨界值系數(shù)步驟由以下步驟組成: (2a)選用陽性對(duì)照品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)10孔，計(jì)算陽性對(duì)照品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值SEwtt; (2b)選用臨界值一級(jí)參考品作為待測(cè)樣本，進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)反應(yīng)2孔，計(jì)算臨界值一級(jí)參考品的各個(gè)指標(biāo)信號(hào)值平均值(2c)利用下述公式求取指標(biāo)臨界值系數(shù) 指標(biāo)臨界值系數(shù)=陽性對(duì)照品中該指標(biāo)信號(hào)值的平均值(馬_) /臨界值參考品該指標(biāo)信號(hào)值的平均值(XiA)。
11.如權(quán)利要求7所述的用于聯(lián)合檢測(cè)自身抗體蛋白質(zhì)微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法，其特征在于，所述在每次實(shí)驗(yàn)中，利用陽性對(duì)照品中的各指標(biāo)信號(hào)值與對(duì)應(yīng)的各指標(biāo)的臨界值系數(shù)確定此次實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的臨界值信號(hào)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出判定步驟由以下步驟組成: (3a)取每次芯片實(shí)驗(yàn)時(shí)，陽性對(duì)照品中各指標(biāo)信號(hào)值，用陽性對(duì)照品的臨界值系數(shù)除各指標(biāo)信號(hào)值得到各指標(biāo)的臨界信號(hào)值； (3 b)比較每個(gè)樣本中各指標(biāo)信號(hào)值與該指標(biāo)臨界信號(hào)值大小，當(dāng)大于臨界信號(hào)值時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為陽性，否則判定為陰性。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103777025SQ201210398932
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】喻長(zhǎng)杰, 柳飛舟, 姚涌 申請(qǐng)人:上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司