專利名稱：茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基殘余物的定量檢測(cè)，尤其適應(yīng)新固相多肽合成中，經(jīng)茚三酮試劑處置，測(cè)得吸光值，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于判定未知樹脂肽中的殘余氨基含量的方法。
背景技術(shù)：
在固相法合成多肽的過程中，游離的氨基數(shù)量是合成完成度的一種直接體現(xiàn)，但是現(xiàn)在沒有一個(gè)準(zhǔn)確的方法可以得到殘余氨基的具體數(shù)量，以驗(yàn)證其結(jié)果的可信度與準(zhǔn)確性；因此制作標(biāo)準(zhǔn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線用于對(duì)未知樹脂肽中游離的氨基進(jìn)行定量分析，有著重要的實(shí)踐價(jià)值。
常規(guī)茚三酮檢測(cè)法用于固相多肽合成中的-NH2殘基定量的檢測(cè)，一般均采用將反應(yīng)后樹脂的吸光值代入公式，通過計(jì)算來(lái)確定合成率，此結(jié)果易受反應(yīng)時(shí)間、加熱溫度、加熱時(shí)間等因素影響，而且由于存在試劑配制的批次差異，從而使結(jié)果會(huì)有較大的浮動(dòng)，而且由于合成的不斷進(jìn)行，氨基酸的增加，也會(huì)使得樹脂肽重量發(fā)生變化，使得結(jié)果判定上的準(zhǔn)確度大打折扣，為了避免上述情況的出現(xiàn)，該項(xiàng)目對(duì)茚三酮反應(yīng)試劑進(jìn)行了改進(jìn)，可以在短時(shí)間內(nèi)得出一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)果，并使用脫去保護(hù)基后的合成用樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，使所有的反應(yīng)均在同一條件下進(jìn)行，從而保證了結(jié)果的可信度，可以更可靠的對(duì)游離氨基進(jìn)行定量。文獻(xiàn)檢索披露常規(guī)茚三酮檢測(cè)法多是通過顏色的變化來(lái)對(duì)縮合完成度進(jìn)行判定；該方法使用2種試劑，試劑A :取O. 66mg/ml氰化鉀水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酹乙醇溶液IOml,混勻；試劑B :稱取500mg卻三酮溶于IOml無(wú)水乙醇中；進(jìn)行合成完成度檢測(cè)時(shí)，取縮合反應(yīng)完成后的樹脂肽3mg，使用無(wú)水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入試劑A O. 15ml，試劑B O. 05ml, 100°C加熱10分鐘，看顏色變化來(lái)判定縮合完成度，顏色如果為藍(lán)色或綠色就判定為縮合不完全，顯黃色判定為縮合完全。本發(fā)明構(gòu)思是改進(jìn)的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，用合成的樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)合成率進(jìn)行一個(gè)判斷，其解決的主要問題，一是合成樹脂標(biāo)準(zhǔn)的建立；二是對(duì)游離氨基定量檢測(cè)范圍的確定；三是吸光值的穩(wěn)定性的確定；四是反應(yīng)液改進(jìn)后不加氰化鉀，減少反應(yīng)液配制的危險(xiǎn)性，該定量方法有重要的應(yīng)用推廣價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品樹脂的吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到未知樹脂肽樣品中的殘余氨基含量，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)，用與合成反應(yīng)相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知的樣品進(jìn)行殘余氨基定量檢測(cè)，其步驟如下其I樣品處理
稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計(jì)算樹脂摩爾數(shù)A ;用帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾；將IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應(yīng)2小時(shí)，得到樹脂肽；再經(jīng)25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護(hù)基后的樹脂肽，備用；其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得；其中樹脂摩爾數(shù)的計(jì)算公式
A=M/SD式中A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數(shù)；m 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂的克數(shù)；SD 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；其2檢測(cè)步驟I)將取去除保護(hù)基后的樹脂肽15mg，使用無(wú)水甲醇溶液20ml對(duì)其清洗3次，經(jīng)真空干燥機(jī)處置，其溫度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa ;干燥結(jié)束，稱取I. Omg, I. 5mg, 2. Omg,
2.5mg，3. Omg ;分別加入 300ul Buffer A :和 75ul Buffer B，混和均勻，用 100°C水浴加熱15min,并置于15-20°C水中冷卻至室溫；取25ul的反應(yīng)后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下進(jìn)行吸光值讀取，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)稱取待測(cè)樣 2. 0-3. Omg，加入 Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混勻，100°C7jC浴加熱15min，并用冷水冷卻，取25ul的反應(yīng)后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下測(cè)定吸光值；其中Buffer A的配制:5ml卩比唳+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；其中Buffer B的配制500mg卻三酮+IOml乙醇；3)由于使用未合成的Rink Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)品，所以在計(jì)算時(shí)需要將由于縮合所增加的分子量減去，以保證計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性；去除樹脂肽增量的影響公式
V _m^ — 1+SD ^
IOOO式中X :去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；W :樹脂妝理論分子量；m :樹脂肽實(shí)際稱量重量；SD Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；其中4mer樹脂肽的理論分子量為541. 73 ；Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值為0. 38mmol/g。本發(fā)明的作用機(jī)理是氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共同加熱時(shí)，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨基結(jié)合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍(lán)紫色化合物，根據(jù)溶液中游離氨基的多寡，其顏色也會(huì)有深淺變化，可以通過分光光度計(jì)測(cè)量吸光值，根據(jù)吸光值的不同，可以對(duì)反應(yīng)中的氨基含量進(jìn)行判定。本方法采用與合成反應(yīng)相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)于固相合成過程中的氨基殘余含量判定更為準(zhǔn)確，可以更加直觀的對(duì)合成的預(yù)期結(jié)果進(jìn)行判定，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步闡明。本方法的實(shí)施步驟(一)反應(yīng)試劑的制備Buffer A :5ml 卩比唳 +1. 185g 苯酌· +5ml 乙醇混勻；Buffer B 500mg 卻三酮 +IOml 乙醇； 25%哌啶溶液25ml哌啶溶液+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻；(二)樣品處理I)固相合成過程稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g，并根據(jù)樹脂摩爾數(shù)的計(jì)算公式算出所需的樹脂摩爾數(shù)A，選用帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾，使用IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，在含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反應(yīng)2小時(shí)，得到樹脂肽，再經(jīng)25%哌啶溶液處理30分鐘，其中每摩爾樹脂肽加入25%的哌啶溶液26ml，得去除脫保護(hù)基后的樹脂肽，備用；樹脂摩爾數(shù)的計(jì)算公式
illA —式中A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數(shù)；m 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂的克數(shù)；SD 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；2)標(biāo)準(zhǔn)品制備用與合成反應(yīng)相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)25%哌啶溶液(每摩爾樹脂加26ml)處理30分鐘，使用無(wú)水甲醇溶液(每100毫克樹脂使用5ml無(wú)水甲醇溶液)清洗3次，之后使用真空干燥機(jī)進(jìn)行干燥(溫度45°C，真空度95KPa)。3)樣品制備取脫去保護(hù)基后的樹脂肽8mg，使用無(wú)水甲醇溶液15ml對(duì)其清洗3次，之后使用真空干燥機(jī)進(jìn)行干燥(溫度45°C，真空度93. 3KPa)。4)加入 Buffer A 300ul ；Buffer B 75ul,混勻，100°C水浴加熱 15min,并用冷水冷卻15min，之后取反應(yīng)液25ul+l. Oml 60%的乙醇溶液混勻;其中Buffer A :5ml吡啶+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；Buffer B 500mg卻三麗+IOml乙醇；5)在0D570下進(jìn)行吸光值讀取。(二)檢測(cè)流程I)對(duì)處理后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行取樣,精確稱取I. Omg、I. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、3. Omg的樹脂；2)對(duì)處理后的樣品進(jìn)行取樣，精確稱取3. Omg,并記錄重量；3)每管標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均加入Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混勻，100°C水浴加熱15min，并用冷水冷卻15min，取25ul的反應(yīng)后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下進(jìn)行吸光值讀取，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其驗(yàn)證結(jié)果見表I。表I
權(quán)利要求
1.茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)，其特征在于用與合成反應(yīng)相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)未知的樣品進(jìn)行殘余氨基定量檢測(cè)，其步驟如下 其I樣品處理 稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計(jì)算樹脂摩爾數(shù)A ;用帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸,每種氨基酸取2A摩爾；將IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應(yīng)2小時(shí)，得到樹脂肽；再經(jīng)25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護(hù)基后的樹脂肽，備用； 其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得； 其中樹脂摩爾數(shù)的計(jì)算公式
2.按照權(quán)利要求I所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于選用的合成用樹脂為RinkAmide_MBHA Resin，購(gòu)自天津南開和成科技有限公司，貨號(hào)HCRAm04-l_l ;哌啶購(gòu)自Sigma，貨號(hào)110-89-4 ;氮甲基吡咯烷酮購(gòu)自張家港合泰化工有限公司，貨號(hào)872504 ;茚三酮購(gòu)自Sigma，貨號(hào)N4876;吡啶購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，貨號(hào)xkl3-201_00115 ；帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，購(gòu)自吉爾生化的上海有限公司。·
全文摘要
本發(fā)明提供的茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)，使用合成的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行連續(xù)的重量遞增稱量，可以得到一組標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)過茚三酮試劑反應(yīng)，在OD570下讀取吸光值，制得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對(duì)未知的肽樹脂進(jìn)行游離的氨基定量檢測(cè)分析。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102928362SQ20121039911
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者趙毅, 鄭先強(qiáng), 謝仁軍, 肖璐恒, 李延濤, 黃炯, 唐磊 申請(qǐng)人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司