專利名稱：聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電化學測試技術(shù)，以及環(huán)境、醫(yī)學衛(wèi)生領(lǐng)域中生物分子與細菌的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是生物傳感器制作技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
電化學免疫傳感器是一種將電化學檢測技術(shù)與免疫學技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一種新型免疫傳感器，這種傳感器是將各種各樣的特異性抗原(Antigen，Ag)-抗體(Antibody,Ab)固定到電極的表面,通過固定化的分子識別物質(zhì)和分析物之間的免疫反應(yīng)，把抗原和抗體這種特異性結(jié)合的信息轉(zhuǎn)換為可檢測的電化學信號(電流或電位等)。根據(jù)測量信號的不同，電化學免疫傳感器大致可以分為電導(dǎo)型、電流型、電位型、電容型和阻抗型等多種類型的免疫傳感器。
電化學免疫傳感器具有很多優(yōu)點第一，檢測快速、實時，如檢測一對生物大分子的相互作用時，通常只需要幾分鐘或者幾十分鐘，而且在檢測過程中，就可以觀察到生物分子之間的相互作用的結(jié)果；第二，結(jié)構(gòu)、操作簡單，不需要昂貴的檢測儀器設(shè)備，也不需要專門的操作人員，更不需要對生物樣品做標記；第三，靈敏度高、檢出限低，抗原一抗體的特異性結(jié)合決定了免疫傳感器的高靈敏度，少受其他干擾；第四，選擇性高、特異性好，復(fù)雜的樣品通常不需要經(jīng)過分離或者掩蔽處理就能直接測定。這種方法克服了傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、柱免疫分析(ICA)、熒光免疫技術(shù)(FIAS)、放射性免疫分析(RIA)的抗體標記、輻射危害、背景噪音信號大、繁瑣復(fù)雜的清洗過程、分析時間長、儀器貴重和需要專業(yè)操作人員等缺點。電化學阻抗譜分析方法(EIS)是用來檢測修飾有生物分子的電極界面的生物學反應(yīng)特性的電化學技術(shù)，是一種測量電極界面性質(zhì)的有效工具。阻抗型免疫傳感器的分析原理是基于抗原/抗體之間的特異性結(jié)合而降低了電活性探針分子同電極之間的電子轉(zhuǎn)移速率，即增加了電子轉(zhuǎn)移阻抗。通過測量免疫反應(yīng)前后電子轉(zhuǎn)移阻抗之差(
—Rrf)可以實現(xiàn)高靈敏檢測的目的。近年來，由于電化學阻抗生物傳感器具有制備簡便、
成本低廉、易于封裝、快速實時和小型化監(jiān)測等特點，所以在微生物檢測、醫(yī)療診斷、藥物殘留、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境檢測、食品分析等領(lǐng)域得到廣泛研究。
性能優(yōu)良的免疫材料固定化方法是研制免疫傳感技術(shù)的核心，成為改善電化學免疫傳感性能的最有效途徑之一，也一直是傳感工作者探索的主要目標之一，并代表當前免疫分子固定化技術(shù)的發(fā)展方向。因此開發(fā)廉價、靈敏度高、特異性好和壽命長的免疫傳感器固定化技術(shù)已成為研究和探索的目標。聚合物(高分子材料)是指具有相同化學結(jié)構(gòu)的單分子物質(zhì)，經(jīng)聚合反應(yīng)將化學鍵連接在一起而形成的大分子物質(zhì)，它因其合成的靈活性、結(jié)構(gòu)的預(yù)設(shè)性和性質(zhì)的多樣性等特點，在傳感器的發(fā)展中具有舉足輕重的地位。目前研制的阻抗傳感器的工作電極多數(shù)都是單電極體系，與當今先進的生物芯片相比，其陣列化和微型化程度還需要大大提高，對于檢測體系的局部特征研究也很少有報道。所以，發(fā)展局部阻抗譜，對研究體系的微觀過程勢在必行。在隨著先進科學技術(shù)和微細加工技術(shù)的不斷革新，在提高電極的品質(zhì)因數(shù)和靈敏度的同時，也要提高電極微陣列的密度和通量，因此，電極陣列化和多通道實時檢測是未來阻抗型電化學免疫傳感器的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提出一種提高電極微陣列的密度和通量的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法。本發(fā)明技術(shù)方案是將超微孔膜材料聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-C0-PAA)先修飾到玻碳電極表面，再采用鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液活化膜微孔內(nèi)壁上的羧基(-C00H)，將單克隆抗體以共價結(jié)合形式固定到膜微孔內(nèi)。本發(fā)明公開了一種基于聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-co-PAA)的兩親共聚物修飾玻碳電極，在電極表面形成微孔膜，獲得了組合超微電極。在微孔內(nèi)壁，經(jīng)鹽酸I-乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)/ N -羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化微孔膜表面的羧基，以共價鍵的形式與單克隆抗體結(jié)合的方法，固定了抗體，以此制備了一種無標記免疫傳感器。通過電化學交流阻抗技術(shù)，阻抗相對變化值與抗原濃度對數(shù)成正比的關(guān)系，建立了一種免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本發(fā)明的檢測方法與常規(guī)電極的電化學交流阻抗測定技術(shù)相比，電化學交流阻抗技術(shù)，信號得到功能性的放大，檢測抗原靈敏度更高，本方法可用于人血清中h-IgG的無標記檢測。本發(fā)明所述鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液中，鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合投料摩爾比為I : I。本發(fā)明所述修飾是將濃度為10 mg/mL的聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-C0-PAA)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液滴涂到玻碳電極上，待二甲基甲酰胺揮發(fā)完全之后，用二次水沖洗電極表面。選用聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-co-PAA)的兩親共聚物材料，通過自組裝技術(shù)，在常規(guī)圓盤電極表面自組裝，可在電極表面形成納米級微孔薄膜。本發(fā)明將單克隆抗體以共價結(jié)合形式固定到膜微孔內(nèi)的具體方法是先將玻碳電極浸入鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液中，活化Ih后取出玻碳電極，用二次水洗去表面過量的混合液，再用氮氣吹干玻碳電極表面；再將玻碳電極浸入pH為7. O的h-IgG單克隆抗體的磷酸緩沖溶液中，置于4°C下12 h后取出玻碳電極，再將玻碳電極放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37. (TC水浴中30 min,以封閉非特異性位點，接著用二次水沖洗除去表面多余的牛血清蛋白，最后，將制備好的電極浸入PH為7.0的磷酸緩沖溶液中，置于4°C條件下保存。上述鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液的濃度為O. 2 mol/L。本發(fā)明在微孔內(nèi)壁，經(jīng)鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)/ N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化微孔膜表面的-C00H，以共價鍵的形式與單克隆抗體結(jié)合的方法，達到固定抗體的目的。另，本發(fā)明所述鹽酸I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液的濃度為O. 2 mol/L。所述h-IgG單克隆抗體的磷酸緩沖溶液的濃度為I μ g/mL。


圖I為PAN-co-PAA在電極表面形成的微孔膜的掃描電鏡圖(荷蘭Philips公司XL - 30E掃描電子顯微鏡，電子槍的電壓設(shè)置為20千伏,樣品表面噴金)
圖2A為以裸玻碳電極制備傳感器在K3 [Fe (CN) 6]中的穩(wěn)態(tài)伏安圖。圖2B為以本發(fā)明方法制備的傳感器在K3 [Fe(CN)6]中的穩(wěn)態(tài)伏安圖。圖3A為本發(fā)明方法制備的傳感器檢測h-IgG的EIS信號圖。
圖3B為本發(fā)明方法制備的傳感器檢測h-IgG的線性關(guān)系圖。
具體實施例方式一、傳感器的制備過程
I、前處理玻碳電極(直徑3 mm)首先是用細砂紙拋光處理，然后用超細的Al2O3粉末為拋光粒子，采用絲綢再在玻碳電極表面進行拋光，接著用二次水沖洗。最后，再采用等體積的二次水、乙醇和硝酸的混合溶液進行超聲處理。經(jīng)過預(yù)處理后，將玻碳電極在O. 5 mol/L H2SO4溶液中，在-O. 5到+1. 4 V范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描至獲得穩(wěn)定的伏安曲線為止。2、修飾室溫下，在空氣濕度>60 %的條件下，用微量進樣器移取10 UL濃度為10mg/mL聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-co-PAA)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液滴涂到事先已經(jīng)處理好的玻碳電極上。等到DMF揮發(fā)完全之后，用二次水沖洗電極表面，此時微孔薄膜在電極表面上自組裝形成。通過掃描電鏡技術(shù)、電化學表征技術(shù)證明該電極具有超微組合電極的特點，如圖I所示，所有微孔均為納米級。3、固定先將上述電極浸入濃度為O. 2 mol/L的EDC與NHS (摩爾比I :1)組成的混合溶液中，活化lh，然后取出電極，用二次水洗去表面過量的混合液，再用氮氣吹干電極表面待用。再將電極浸入O. 2 mL濃度為I μ g/mL的h_IgG單克隆抗體的磷酸緩沖溶液(pH=7. O)中，置于4°C下12 ho然后將電極取出后放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37. (TC水浴中30 min,以封閉非特異性位點，接著用二次水沖洗除去表面多余的牛血清蛋白。將制備好的電極浸入至磷酸緩沖溶液(PH=7. O)中，置于4°C保存?zhèn)溆?。二、傳感器的電化學表征
以裸玻碳電極和本發(fā)明制備傳感器(抗體結(jié)合前)分別為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉬絲電極為對電極組成的三電極體系在CHI660A電化學工作站上進行電化學測試與表征。圖2A和圖2B分別為裸玻碳電極和本發(fā)明制備傳感器在6 X 10_3 mol/L K3Fe (CN)6和I mol/L KNO3溶液中的循環(huán)伏安圖。如圖2A所示，50 mV/s掃描速度時裸玻碳電極的循環(huán)伏安圖為典型的“峰形”的伏安曲線，表明此時K3Fe (CN) 6發(fā)生的氧化還原反應(yīng)是受線性擴散控制的。如圖2B所示，當掃描速度為5 mV/s時，納米孔修飾玻碳電極的伏安曲線變?yōu)榈湫偷某㈦姌O的穩(wěn)態(tài)“S”形曲線，表明Fe(CN)63 —/Fe(CN)64一在微孔內(nèi)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)傳質(zhì)速率很快。微孔納米孔修飾玻碳電極具有超微電極的特征。當掃描速度達到為50 mV/s時，循環(huán)伏安圖又轉(zhuǎn)為“峰形”的伏安曲線。三、h-IgG的電化學交流阻抗測定
免疫傳感器阻抗的相對變化值的測定在含有5 mmol/L的[Fe (CN) 6] 3_/4_ O. I mol/L的PBS和KNO3底液中，采用電化學交流阻抗法進行測定。電化學交流阻抗實驗在Autolab電化學工作站(Ecochemie, Netherlands)上進行。以制備電極為工作電極，飽和甘萊電極(SCE)為參比電極電化學交流阻抗測定的頻率范圍是KT1 Hz到IO6 Hz，使用開路電位(OCP)，正弦波電位的振幅為10 mV。圖3A 中，a e 對應(yīng)的 h_IgG 濃度分別為 O. 1，1，5，50，500 ng/mL。從圖3A的a e曲線可以看出隨著h_IgG濃度的增加，Nyquist圖半圓的直徑·逐漸變大，逐漸增加。這是由于當h-IgG與抗體結(jié)合時，隨著h-IgG濃度的增加，無活性電子和傳質(zhì)封閉層隨之增加，極大的阻礙了電子傳遞。用阻抗的相對變化值對h-IgG抗原濃度對數(shù)做圖，可以得出線性范圍為10—1到5. O
IO2 ng/mL，如圖 3B 所示。線性回歸方程為厶Ret % = 697. 09 + 364. 31g[h-IgG]
(ng/mL)，線性相關(guān)系數(shù)為O. 997，檢出限為O. 05 ng/mL (S/N=3)。高濃度的h_IgG的檢測可以通過用pH=7. 4的PBS稀釋后再檢測。提取三名人的新鮮血清標本，留取血清I 2 mL。取10 μ L血清用PBS緩沖溶液稀釋，根據(jù)上述測試方法測定IgG含量，同時加入標樣作加標回收率實驗，實驗結(jié)果見表I。實驗結(jié)果表明實際人血清樣本中h-IgG測量值分別為10. 0,11. 5和13. Og/L，加標回收率分別為91 %、95 %和103 %，相對標準偏差在3. 6 5.5 %之內(nèi)(n=3)。測得人血清中免疫球蛋白IgG平均含量為11. 5 g/L，均在正常人血清人h-IgG含量(8 14 g/L)范圍之內(nèi)，回收率實驗結(jié)果令人滿意。表I :人血清樣本中h-IgG含量及其回收率的測定(測定次數(shù)n=3)
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四、電極測試信號的放大驗證
常規(guī)方法固定IgG抗體電極的制備將同等玻碳電極GCE電極表面拋光,置于含O. 5mmol/L硫堇單體(TH)、0. I mol/L KCl和4 X 10_3 mol/L亞甲基藍(MB)的磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=6. 0)中，于+ I. 5 V的恒電位條件下循環(huán)伏安掃描IOmin至獲得穩(wěn)定的伏安曲線；于-0.45 + 0. 15 V之間以掃速50 mV / s的條件下循環(huán)掃描25圈，將硫堇單體聚合到玻碳電極上；將修飾電極浸入納米金(GNP)溶液中，室溫下置于暗處4 h，取出用二次水沖洗干凈，抗體的固定以及抗原的檢測方法同上。該法的檢測下限是I. O ng/mL。當檢測濃度I. O >: IO2 ng/mL h-IgG抗原時，本發(fā)明的修飾電極與常規(guī)修飾電
極阻抗比較，常規(guī)修飾電極的Rct = 1375 ohm，采用本發(fā)明的傳感器在相同條件下來檢測該濃度的的厶:Ret’ = 44230 ohm，厶Ret’的值約是Δ Rct的32倍。由此可以得出，
常規(guī)方法固定抗體的傳感器與本發(fā)明的傳感器兩種方法相比，后者可以將免疫反應(yīng)的信號放大約32倍，檢測下限低20倍。因此得出，本發(fā)明用于多發(fā)性骨髓瘤人體血清中h-IgG的檢測技術(shù)，操作簡便，儀 器設(shè)備簡單，成本低廉，測定快速，可以更加靈敏的檢測h-IgG，能夠為病癥診斷和療效判斷提供依據(jù)。
權(quán)利要求
1.聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于將超微孔膜材料聚丙烯腈一共聚一丙烯酸先修飾到玻碳電極表面，再采用鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液活化膜微孔內(nèi)壁上的羧基，將單克隆抗體以共價結(jié)合形式固定到膜微孔內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述鹽酸I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合投料摩爾比為1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述玻碳電極在修飾前經(jīng)拋光處理，清洗后，再采用由二次水、乙醇和硝酸的混合溶液超聲處理，然后將玻碳電極在O. 5 mol/L的H2SOpK溶液中，在-O. 5到+1.4 V范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描直至獲得穩(wěn)定的伏安曲線為止。
4.根據(jù)權(quán)利要求書3所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述二次水、乙醇和硝酸的混合溶液中二次水、乙醇和硝酸的投料體積比為I : I :Io
5.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述修飾是將濃度為10 mg/mL的聚丙烯腈一共聚一丙烯酸的二甲基甲酰胺溶液滴涂到玻碳電極上，待二甲基甲酰胺揮發(fā)完全之后，用二次水沖洗電極表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于將單克隆抗體以共價結(jié)合形式固定到膜微孔內(nèi)的方法是先將玻碳電極浸入鹽酸I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，活化Ih后取出玻碳電極，用二次水洗去表面過量的混合液，再用氮氣吹干玻碳電極表面；再將玻碳電極浸入pH為7. O的h-IgG單克隆抗體的磷酸緩沖溶液中，置于4°C下12 h后取出玻碳電極，再將玻碳電極放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37. (TC水浴中30 min，然后用二次水沖洗除去表面多余的牛血清蛋白，最后，將制備好的電極浸入PH為7. O的磷酸緩沖溶液中，置于4°C條件下保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求書6所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述鹽酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液的濃度為O. 2 mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求書6或7所述的聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，其特征在于所述h-IgG單克隆抗體的磷酸緩沖溶液的濃度為I μ g/mL。
全文摘要
聚合物自組裝超微孔膜免疫組合傳感器的制備方法，涉及電化學測試技術(shù)領(lǐng)域，將超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸先修飾到玻碳電極表面，再采用鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液活化膜微孔內(nèi)壁上的羧基，將單克隆抗體以共價結(jié)合形式固定到膜微孔內(nèi)，以此制備了一種無標記免疫傳感器。通過電化學交流阻抗技術(shù)，阻抗相對變化值與抗原濃度對數(shù)成正比的關(guān)系，建立了一種免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本發(fā)明的檢測方法的電化學阻抗信號得到放大，檢測抗原靈敏度更高。本方法可用于人血清中h-IgG的無標記檢測。
文檔編號G01N27/327GK102901822SQ201210405950
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者王赪胤, 徐丹, 張莉, 管俊, 胡效亞 申請人:揚州大學